Ανάπτυξη μικροδιατάξεων (chips) για την ανάλυση νουκλεϊκών οξέων

Abstract

The development of miniaturized systems for chemical analysis (lab-on-a chip systems) is a new and rapidly growing field with a plethora of applications in Chemistry and Biology. The manufacturing of analytical microsystems is based on photolithographic techniques employed by the microelectronics industry in order to pattern and fabricate microstructures on silicon or glass substrates. Chapter 1 (Introduction) of the present dissertation provides a brief description of the principle of the polymerase chain reaction (PCR) and reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), the factors affecting their specificity and yield as well as instrumental considerations. Various methods for analysis of amplification products are described. An overview of microfabricated systems for PCR is also presented. Next, the principle of capillary electrophoresis is discussed along with applications of conventional and miniaturized capillary electrophoresis systems. Chapter 2 presents the design, microfabrication and study of a high-throughput, monolithic, reusable chip for the functional integration of reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR) in a continuous-flow mode. The chip allows for rapid amplification as well as selection of the number of amplification cycles and the sample volume. A microchannel network was etched that defines four distinct temperature zones, one for RT and three for PCR (denaturation, annealing and extension). Very rapid heat transfer and thermal cycling were achieved due to both the high surface-to-volume ratio and the short linear thermal diffusion distance in the microfluidic channels. As a result, we were able to collect PCR products in only 6 min after 30 amplification cycles. Amplification products were analyzed by agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining. Successful amplification of a single copy gene from human genomic DNA was carried out. The high-throughput capability of the chip was demonstrated by running, simultaneously, multiple DNA and RNA samples. Chapter 3 describes the combination of the continuous-flow DNA and RNA amplification chip with an in-house built laser-induced fluorescence (LIF) system for rapid (within seconds) and automatable determination of the amplification products. To date the products of continuous-flow PCR and RT-PCR chips were analyzed by agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining. As a result, a rapid amplification procedure was followed by a time-consuming step. On the contrary, the proposed LIF system achieves high detectability and speed and is amenable to automation. Upon exiting from the chip, the products are mixed with the intercalating dye SYBR Green I and introduced into the LIF system. The fluorescence is linearly related to the concentration of amplified DNA. No sample carry-over was observed in the chip or the LIF detector. In Chapter 4, a microfabricated, inexpensive, reusable capillary electrophoresis chip and a laser-induced fluorescence system were developed, in-house, for the rapid DNA-based analysis of genetically modified organisms (GMO). The detection of genetically modified soybean in the presence of unaltered soybean was chosen as a model. The chip was composed of two glass plates thermally-bonded together to form a closed structure. Photomasks with cross-topology were prepared rapidly by using polymeric material instead of chrome plates. The separation and detection of PCR-amplified sequences was completed in less than 60 seconds.

Η ανάπτυξη μικροδιατάξεων (chips) για χημική ανάλυση αποτελεί ένα νέο και ταχύτατα εξελισσόμενο πεδίο με πληθώρα εφαρμογών στη Χημεία και τη Βιολογία. Η κατασκευή των αναλυτικών μικροσυστημάτων βασίζεται σε φωτολιθογραφικές τεχνικές παρόμοιες με εκείνες που χρησιμοποιούνται στη μικροηλεκτρονική για την παραγωγή ολοκληρωμένων κυκλωμάτων. Στο Κεφάλαιο 1 (Εισαγωγή) της παρούσας διατριβής περιγράφονται, συνοπτικά, η αρχή της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) και της αντίστροφης μεταγραφής-PCR (RT-PCR), οι παράγοντες που επιδρούν στην εξειδίκευση και την απόδοση της αντίδρασης και τα όργανα που χρησιμοποιούνται για θερμική κυκλοποίηση. Περιγράφονται επίσης διάφορες μέθοδοι ανάλυσης προϊόντων PCR. Στη συνέχεια συζητούνται μικροσυστήματα για εκτέλεση PCR. Ακολουθεί η περιγραφή της αρχής της τεχνικής της ηλεκτροφόρησης σε τριχοειδές (CE) και οι εφαρμογές των κλασσικών συστημάτων CE και των μικροσυστημάτων CE στην ανάλυση DNA. Το Κεφάλαιο 2 της διατριβής περιγράφει τη σχεδίαση, κατασκευή και μελέτη υάλινης μονολιθικής μικροσυσκευής (chip) συνεχούς ροής για τη λειτουργική σύζευξη της αντίστροφης μεταγραφής (RT) και της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR). Το chip εκτελεί ταχύ πολλαπλασιασμό DNA και RNA και επιτρέπει την επιλογή αριθμού κύκλων και όγκου δείγματος. Η συσκευή περιλαμβάνει δίκτυο μικροκαναλιών, το οποίο ορίζει 4 διακριτές ζώνες με προκαθωρισμένες θερμοκρασίες. Κατά τη διέλευση του δείγματος και των αντιδραστηρίων, στη μία ζώνη εκτελείται η RT και στις υπόλοιπες πραγματοποιείται η PCR (αποδιάταξη DNA, δέσμευση εκκινητών και πολυμερισμός). Λόγω της υψηλής τιμής του λόγου επιφάνεια/όγκος η μεταφορά θερμότητας είναι ταχεία, γεγονός το οποίο καθιστά εφικτή τη συλλογή προϊόντων PCR σε 6 min μετά από 30 κύκλους της αντίδρασης. Επίσης επιτεύχθηκε ταυτόχρονος πολλαπλασιασμός νουκλεϊκών οξέων διαφόρων δειγμάτων σε συνεχή ροή. Το Κεφάλαιο 3 περιλαμβάνει την ανάπτυξη ανιχνευτή φθορισμού επαγώμενου με λέιζερ (LIF) για τον ταχύ (σε δευτερόλεπτα) προσδιορισμό των προϊόντων πολλαπλασιασμού DNA και RNA που λαμβάνονται απο τη μικροσυσκευή PCR/RT-PCR συνεχούς ροής. Μέχρι σήμερα, η ανάλυση των προϊόντων PCR/RT-PCR απο μικροσυστήματα συνεχούς ροής γινόταν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης και στη συνέχεια χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο. Συνεπώς η ταχεία διαδικασία πολλαπλασιασμού, που επιτυγχάνεται με το chip, ακολουθείται από ένα χρονοβόρο στάδιο ανάλυσης των προϊόντων. To προτεινόμενο σύστημα LIF υπερέχει σε ανιχνευσιμότητα και ταχύτητα προσδιορισμού και παρέχει τη δυνατότητα αυτοματοποίησης. Τα προϊόντα πολλαπλασιαμού DNA ή RNA μετά την έξοδό τους από το chip αναμιγνύονται με διάλυμα της φθορίζουσας χρωστικής SYBR Green I και στη συνέχεια εισάγονται στον ανιχνευτή για μέτρηση. Η ένταση του φθορισμού είναι γραμμική συνάρτηση της συγκέντρωσης του DNA. Το Κεφάλαιο 4 περιλαμβάνει την ανάπτυξη υάλινης μικροδιάταξης (chip) για τον ταχύ διαχωρισμό μορίων DNA με ηλεκτροφόρηση σε τριχοειδές και ταυτόχρονη ανίχνευσή τους με σύστημα φθορισμού επαγώμενου με λέιζερ. Το προτεινόμενο σύστημα εφαρμόζεται στην ανίχνευση γενετικά τροποποιημένων οργανισμών, χρησιμοποιώντας τη σόγια ως μοντέλο. Για την παρασκευή του chip ηλεκτροφόρησης σε τριχοειδές κατασκευάστηκε φωτομάσκα από πολυμερές υλικό αντί των πλακών χρωμίου οι οποίες έχουν υψηλό κόστος. Επιτεύχθηκε διαχωρισμός και ανίχνευση των προϊόντων PCR σε χρόνο 60 δευτερολέπτων.