Συγκριτική μελέτη της παρουσίας οργανικών και ανόργανων στοιχείων στον εγκέφαλο της γάτας και των παθολογοανατομικών αλλοιώσεων που συνδέονται με την ηλικία

Abstract

The aging process causes various functional disorders and histopathological lesions in the CNS of humans and animals. The aim of our study was to initially investigate the presence of 28 endogenous and toxic metals, as well as of the antioxidant enzymes SOD-1 and MT-I/II and, as far as possible, their potential association with aging and then to correlate them with the age-related histopathology, including amyloid beta deposits, in the aged feline brain. For the implementation of the above objectives, the brains of 30 cats, 27 aged and 3 young controls, were studied. The cats were either admitted dead for necropsy or euthanized due to debilitating non-neurological disorders, at the Laboratory of Pathology, School of Veterinary Medicine, AUTH. Then they were divided according to their age into the following groups: group A (Υoung Controls), group B (Mature), group C (Senior) and group D (Super senior). Immediately after euthanasia or up to 3 hours postmortem, necropsy was performed and the brains were removed, separated into two halves, and routinely fixed. From the right half tissue samples for histopathological and immunohistochemical examination were obtained, and involved the temporal and frontal lobes, hippocampus, thalamus, striatum and cerebellum. Finally, they were embedded in paraffin. The following histochemical stains were applied to consecutive histological sections: H-E, to determine the presence of age-related histopathological lesions, periodic acid (PAS), to assess the presence of lipofuscin granules and polyglucosan bodies, and Klüver Barrera, to assess the degree of degeneration of white matter nerve fibers. Finally, Perl's/DAB and Rhodanine histochemical stains were applied to detect iron (Fe) and copper (Cu), respectively. Additionally, on serial tissue sections, immunohistochemistry was performed using the Super-Sensitive Polymer-HRP IHC Detection System, to detect amyloid β42 peptide (Aβ42), GFAP, MT-I/II and SOD-1. MT-I/II and SOD-1 are antioxidant enzymes. In particular, metallothioneins participate in the homeostasis and transport of endogenous metals, such as copper (Cu) and zinc (Zn). Overexpression of the above substances has a protective effect against aging and neurodegenerative diseases, due to their ability to bind endogenous metals and therefore inhibit their toxic action. Additionally, the presence of the enzyme SOD-1, which binds Cu and Zn, protects the central nervous system from oxidative stress. All the above histological sections were examined by optical microscopy and the age-related lesions, the presence of Fe and Cu, as well as the presence of Αβ42, GFAP, MT-I/II and SOD-1 were graded. Statistical analysis with X2 and Kruskal Wallis tests was applied to these results. Finally, tissue samples were collected from the left half of the brain, examined for the presence of 28 endogenous and toxic metals and evaluated quantitatively by applying the method ICP-MS (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry). One-way ANOVA and Duncan's tests were applied for statistical analysis and evaluation of quantitative analysis results. After the study of the histological sections, description and scoring of age-related histopathological lesions and the presence of Aβ42 and GFAP were performed, as described in previous studies. Regarding the presence of Aβ42, in addition to the deposits reported so far in the feline brain, this was also detected in the cytoplasm of a small number of astrocytes, in 6 aged animals which presented concomitant intense astrogliosis. For the study of GFAP in astrocytes, a combined semi-quantitative and morphological evaluation and final grading was carried out. In addition, Perl's/DAB-stained sections showed extracellular Fe deposits in the form of plaques (IPs) of two types, compact and diffuse, as well as intracellular deposition of Fe within neurons and glial cells. Finally, band-like Fe deposits associated with myelin were also observed. At the same time, it was found that the neuronal nucleolus is a “hot spot” for Fe, intracellularly. Also, in the gray and white matter of the frontal lobe and in the thalamus, a statistically age-related significant increase in the presence of Fe in the form of IPS was found (p≤0,05). Similarly, in the cerebellum a statistically significant increase in Fe bound to myelin was observed (p≤0,05). Also, with Rhodanine staining, the presence of Cu was observed in the perikaryon of neurons, as well as in the cytoplasm of glial cells.MT-I/II expression was immunohistochemically observed in astrocytes, neurons, meningothelial cells, choroid plexus epithelial cells, ependymal cells as well as the vessel wall of the brain, meninges and choroid plexus. The expression of the above enzyme in the majority of the examined variables showed an increase with age (p≤0,05), which leads us to the conclusion that MT-I/II could serve as potential marker of aging in the cat. Finally, SOD-1 enzyme was detected mainly in neurons, and to a lesser extent in astrocytes, vascular tunica media, meningothelial cells, choroid plexus epithelial cells and ependymal cells. Regarding the concentration of metals in the brains we studied, it is interesting to note that the ICP-MS method detected all metals examined, including toxic ones. However, no statistically significant differences between age groups were found for any of them. Original elements of our research are: a) Τhe detection of 28 endogenous and toxic metals in the feline brain by the application of ICP-MS. b) Τhe investigation of the presence and distribution of Fe and Cu by the application of special histochemical stains in the brain of old cats. c) Τhe immunohistochemical investigation of the antioxidant enzymes MT-I/II and SOD-1 expression. Our results we believe strengthen the view that the cat is a suitable natural model animal for the study of the pathogenesis of aging and/or neurodegenerative diseases in animals and humans.

Η διαδικασία της γήρανσης προκαλεί τόσο λειτουργικές διαταραχές όσο και ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις στο ΚΝΣ του ανθρώπου και των ζώων. Σκοπός μας στην παρούσα διατριβή ήταν να διερευνήσουμε την παρουσία 28 ενδογενών και τοξικών μετάλλων, καθώς και των αντιοξειδωτικών ενζύμων MT-I/II και SOD-1 και την πιθανή σύνδεσή τους, στον βαθμό που ήταν δυνατό, με την πάροδο της ηλικίας και με τις παθολογοανατομικές αλλοιώσεις που σχετίζονται με αυτήν, συμπεριλαμβανομένων των εναποθέσεων Αβ στον εγκέφαλο της γάτας. Για την υλοποίηση των παραπάνω στόχων, μελετήθηκαν 30 γάτες, 27 ηλικιωμένες, και 3 νεαρές-μάρτυρες, οι οποίες επιλέχθηκαν μεταξύ των ζώων που προσκομίζονταν νεκρά στο Εργαστήριο Παθολογικής Ανατομικής του Τμήματος Κτηνιατρικής του ΑΠΘ. Στη συνέχεια οι γάτες, με κριτήριο την ηλικία τους, χωρίστηκαν στις εξής ομάδες: ομάδα Α (νεαρές-Μάρτυρες), ομάδα Β (Ώριμες), ομάδα Γ (Παρήλικες) και ομάδα Δ (Υπερήλικες). Αμέσως μετά την ευθανασία ή έως και 3 ώρες μετά το θάνατο, διενεργούνταν νεκροτομή και λήψη του εγκεφάλου και τεμαχισμός του σε δύο ημιμόρια. Ακολουθούσε μονιμοποίησή του και λήψη ιστοτεμαχίων για ιστοπαθολογική και ανοσοϊστοχημική εξέταση. Αυτά προέρχονταν από το δεξιό ημιμόριο του εγκεφάλου και αφορούσαν τον μετωπιαίο και τον κροταφικό λοβό, τον ιππόκαμπο, τον θάλαμο, το ραβδωτό σώμα και την παρεγκεφαλίδα. Τέλος, ακολουθούσε έγκλεισή τους σε παραφίνη. Σε διαδοχικές ιστολογικές τομές εφαρμόστηκαν οι εξής ιστοχημικές χρώσεις: Η-Ε, για τη διαπίστωση της παρουσίας των ιστοπαθολογικών αλλοιώσεων που συνδέονται με την ηλικία, η χρώση του υπεριωδικού οξέος (PAS), για την αξιολόγηση της παρουσίας κοκκίων λιποφουσκίνης και σωματίων πολυγλυκοζάνης και η Klüver Barrera, για την εκτίμηση του βαθμού εκφύλισης των νευρικών ινών της λευκής ουσίας. Τέλος, εφαρμόστηκαν οι ιστοχημικές χρώσεις Perl’s/DAB και Ροδανίνης για την ανίχνευση του σιδήρου (Fe) και του χαλκού (Cu), αντίστοιχα. Επιπλέον, εφαρμόστηκε ανοσοϊστοχημική μέθοδος (Σύστημα Ανίχνευσης Πολυμερούς Υπεροξειδάσης του Χρένου) με τη χρήση αντισωμάτων κατά του πεπτιδίου Αβ42, της GFAP, της MT-I/II και της SOD-1. Τα δυο τελευταία, αποτελούν αντιοξειδωτικά ένζυμα. Ειδικότερα, οι μεταλλοθειονίνες συμμετέχουν στην ομοιοστασία και τη μεταφορά ενδογενών μετάλλων, όπως του Cu και του ψευδαργύρου (Zn). Επισημαίνουμε ότι η υπερέκφραση των παραπάνω ουσιών έχει προστατευτική δράση έναντι της γήρανσης και των νευροεκφυλιστικών νοσημάτων, επειδή έχουν την ικανότητα να δεσμεύουν τα ενδογενή μέταλλα και, συνεπώς, να αναστέλλουν την τοξική τους δράση. Επίσης, η παρουσία του ενζύμου SOD-1, το οποίο δεσμεύει τον Cu και τον Zn, προστατεύει το κεντρικό νευρικό σύστημα από την οξειδωτική καταπόνηση. Όλες οι ιστολογικές τομές εξετάστηκαν με το φωτονικό μικροσκόπιο και βαθμονομήθηκαν οι αλλοιώσεις που σχετίζονται με τη γήρανση, η παρουσία του Fe και του Cu, και τέλος η παρουσία του Αβ42, της GFAP, της MT-I/II και της SOD-1. Στα αποτελέσματα αυτά εφαρμόστηκε στατιστική ανάλυση με τους ελέγχους X2 και Kruskal Wallis. Τέλος, σε ιστοτεμάχια που λήφθηκαν από το αριστερό ημιμόριο του εγκεφάλου, αξιολογήθηκε ποσοτικά η παρουσία 28 ενδογενών και τοξικών μετάλλων με την εφαρμογή της φασματοφωτομετρικής μεθόδου ICP-MS (φασματοφωτομετρία μάζας επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος). Για τη στατιστική ανάλυση και την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των ποσοτικών αναλύσεων εφαρμόστηκαν οι έλεγχοι one-way ANOVA και Duncan. Μετά τη μελέτη των ιστολογικών τομών, διενεργήθηκε καταγραφή και βαθμονόμηση αφενός των ιστοπαθολογικών αλλοιώσεων που συνδέονται με την ηλικία, αφετέρου της παρουσίας του Αβ42 και της GFAP, όπως έχει περιγραφεί σε προηγούμενες μελέτες. Σχετικά με την παρουσία του Αβ42, επισημαίνουμε ότι επιπλέον των εναποθέσεων που έχουν αναφερθεί ως τώρα για τη γάτα, αυτό διαπιστώθηκε και στο κυτταρόπλασμα ολιγάριθμων αστροκυττάρων, σε 6 ηλικιωμένα ζώα που εμφάνιζαν ταυτόχρονα έντονου βαθμού αστρογλοίωση. Για τη μελέτη της GFAP στα αστροκύτταρα διενεργήθηκε συνδυαστικά ημιποσοτική και μορφολογική αξιολόγηση και τελική βαθμονόμηση. Επιπλέον, σε τομές που εφαρμόστηκε η χρώση Perl’s/DAB παρατηρήθηκαν εξωκυτταρικές εναποθέσεις Fe με τη μορφή πλακών (IPs) δύο τύπων, τις συμπαγείς και τις διάχυτες, καθώς και ενδοκυτταρική εναπόθεση σε νευρώνες και νευρογλοιακά κύτταρα. Τέλος, παρατηρήθηκαν και εναποθέσεις Fe που συνδεόταν με τη μυελίνη, οι οποίες παρατηρούνταν με τη μορφή «ζωνών». Παράλληλα, διαπιστώθηκε ότι ο πυρηνίσκος των νευρώνων αποτελεί την κύρια περιοχή εντόπισης του Fe ενδοκυτταρικά. Επίσης, με την πάροδο της ηλικίας στη ΦΟ και τη ΛΟ του μετωπιαίου λοβού και στον θάλαμο διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση της παρουσίας Fe με τη μορφή IPs (p≤0,05). Όμοια, στην παρεγκεφαλίδα παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση του Fe που συνδέεται με τη μυελίνη (p≤0,05). Επίσης, με τη χρώση της Ροδανίνης παρατηρήθηκε η παρουσία Cu στο περικάρυο των νευρώνων, καθώς και στο κυτταρόπλασμα νευρογλοιακών κυττάρων. Η έκφραση της ΜΤ-Ι/ΙΙ ανοσοϊστοχημικά αφορούσε τα αστροκύτταρα, τους νευρώνες, τα επιθηλιοειδή κύτταρα της λεπτομήνιγγας, τα επιθηλιακά κύτταρα του χοριοειδούς πλέγματος, τα επενδυματικά κύτταρα καθώς και το τοίχωμα των αγγείων του εγκεφάλου, των μηνίγγων και του χοριοειδούς πλέγματος. Η έκφραση του παραπάνω ενζύμου στην πλειονότητα των περιοχών που εξετάστηκαν εμφάνιζε αύξηση με την πάροδο της ηλικίας (p≤0,05), γεγονός που μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι θα μπορούσε να αποτελεί δείκτη γήρανσης του εγκεφάλου στη γάτα. Τέλος, το ένζυμο SOD-1 ανιχνεύθηκε, κυρίως, στους νευρώνες, και σε μικρότερο βαθμό στα αστροκύτταρα, τον μέσο χιτώνα των αγγείων, τα επιθηλιοειδή κύτταρα των μηνίγγων, τα επιθηλιακά κύτταρα του χοριοειδούς πλέγματος και τα επενδυματικά κύτταρα. Αναφορικά με τη συγκέντρωση των μετάλλων στους εγκεφάλους που μελετήσαμε, ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι με τη μέθοδο ICP-MS ανιχνεύθηκαν όλα τα μέταλλα που εξετάστηκαν, συμπεριλαμβανομένων των τοξικών. Ωστόσο, για κανένα από αυτά δεν διαπιστώθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ηλικιακών ομάδων. Πρωτότυπα στοιχεία της έρευνάς μας αποτελούν: α) Η ανίχνευση της παρουσίας 28 ενδογενών και τοξικών μετάλλων σε μίγμα που προερχόταν από 5 διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου της γάτας με την εφαρμογή φασματοφωτομετρίας. β) Η διερεύνηση της παρουσίας και της κατανομής του Fe και του Cu με την εφαρμογή ειδικών ιστοχημικών χρώσεων στον εγκέφαλο ηλικιωμένων γατών. γ) Η ανοσοϊστοχημική μελέτη της έκφρασης των αντιοξειδωτικών ενζύμων ΜΤ-Ι/ΙΙ και SOD-1. Τα αποτελέσματά μας πιστεύουμε πως ενισχύουν την άποψη ότι η γάτα αποτελεί κατάλληλο φυσικό ζώο-πρότυπο για τη μελέτη της παθογένειας της γήρανσης ή/και των νευροεκφυλιστικών νοσημάτων στα ζώα και τον άνθρωπο.