Διερεύνηση της βιολογικής επί τόπου αποκατάστασης υπογείων υδάτων ρυπασμένων με εξασθενές χρώμιο

Abstract

High hexavalent chromium [Cr(VI)] concentrations found in the environment during the last decades have raised public concern, owing to its bio-accumulative, carcinogenic, mutagenic, and toxic nature. Multiple health and environmental protection agencies consider Cr(VI) a priority pollutant and have set strict limits for its concentration in the aquatic environment. Throughout the years, various pump and treat physicochemical technologies have been employed to remediate Cr(VI) polluted soil and groundwater (chemical precipitation, adsorption, membrane filtration, ion exchange, etc.). However, these technologies present certain disadvantages, such as secondary pollution, high operational and maintenance cost, and low effectiveness. In contrast, microbial remediated Cr(VI) reduction is an environmentally friendly and cost-effective method that takes advantage of microbial metabolic processes to reduce Cr(VI) to trivalent chromium [Cr(III)], a stable form of Cr that has been found to be less soluble in water, exists mainly as precipitate and is less toxic for organisms.Biological Cr(VI) reduction can occur under both aerobic and anaerobic conditions and is mediated by a variety of enzymes, being cited extracellularly, intracellularly, or in the cytoplasmic membrane. A reduction can also be induced by metabolic byproducts, such as bio-generated Fe(II), hydrogen, and/or sulfides. One significant advantage of bioremediation is that it can be performed in situ without causing the destruction of the site and that it allows for a continuous Cr(VI) reduction process through the addition of electron donors. However, the effectiveness of Cr(VI) microbial reduction can be affected by the specific physicochemical characteristics of the contaminated area, including pH, temperature, other toxic substances, or different electron acceptors. In many cases, Cr(VI) coexists with other harmful pollutants for public health and the environment. Nitrate (NO3−) is one of the most abundant pollutants in groundwater originating mainly from agricultural activities, i.e., excessive use of nitrogenous fertilizers, as well as discharge of not properly treated urban and industrial wastewater. Sulfate (SO42−) is another ubiquitous pollutant in groundwater, originating both from natural and anthropogenic sources, such as weathering of sulfide-containing minerals, volcanic activities, rainfall, seawater intrusion, fertilizers, urban and industrial wastes, and wastewater. In view of the above, the main objective of this PhD thesis is to study the in situ reduction of hexavalent chromium (Cr+6) to trivalent (Cr+3) through the biological action of microbial communities, as a way of restoring underground aquifers contaminated with hexavalent chromium. Within the context of this thesis, the following objectives were set: i) the investigation of the effect of electron acceptor on Cr(VI)-reducing microbial communities under anoxic, anaerobic, and different sulfate-reducing conditions, ii) the evaluation of the effect of a combination of electron donors, including simple and complex organic carbon and iron, on anaerobic or anoxic Cr(VI) reduction and denitrification and on Cr(VI) reduction in the presence of sulfates and iii) the investigation of the chemical and biochemical processes related to the reduction of Cr(VI) that prevail in an underground aquifer, taking into account the flow and transport of the contaminant within the subsurface pores. Two types of experiments, microcosm experiments (or batch experiments) and soil column experiments (or continuous flow experiments) were carried out, with the aim of better simulating conditions representative of the real field conditions occurring in an underground aquifer. The soil microcosm experiments were carried out under four (4) different reducing conditions—anaerobic, anoxic, low and high sulfate concentration—with soil and groundwater collected from a deep Cr(VI) contaminated aquifer in the Asopos River basin. Biomass, soil, and liquid amendments for the batch experiments were provided by four (4) parent cultures-according to the four (4) redox conditions studied- that were developed and maintained in the laboratory. All were exposed to low hexavalent chromium levels (0.5 mg/L) and to different electron acceptors (10 mg/L NO3-N, 100 mg/L SO42−, 400 mg/L SO42− or none). The cultures were developed in two-liter bottles that were sealed with gray butyl rubber stopper and aluminum crimp. They contained a slurry of subsurface material and groundwater (1:4 dry soil to water volume ratio) and 30 mg TSS/L (TSS: total suspended solids) of activated sludge from an anaerobic reactor as inoculum. The parent cultures were acclimatized for a period of at least 135 days prior to providing biomass for the batch experiments. After the acclimatization period, biomass from the parent cultures was used for the batch experiments, where the effect of different ways of biostimulation with the addition of organic or inorganic electron donors or their combination, was investigated.The column experiments were carried out under anaerobic conditions, using two (2) plexiglass columns filled with soil. The soil columns were operated under saturated conditions with their pores filled with water and each was fed with a Cr(VI) solution prepared with filtered groundwater and potassium dichromate (K2Cr2O7). Cr(VI) solutions were kept in two (2) anaerobic containers under an inert nitrogen atmosphere and a two head peristaltic pump was used to connect the reactors with the columns. The effluent of each column was recirculated into the container, in order to better simulate the conditions of an aquifer and its flow velocity. Flow was set at 1 L per day resulting to an average pore velocity of approximately 0.91 m/day. The following were studied: i) the natural reducing capacity of the soil without the addition of an electron donor, ii) the abiotic reduction of Cr(VI) using ferrous iron, iii) the biological reduction of Cr(VI) using organic carbon sources and the coupled abiotic-biotic reduction of Cr(VI) via possible regeneration of Fe(II) due to the addition of organic carbon sources. Samples were extracted periodically from the parent cultures, batch experiments and column experiments, to conduct analyses that led to clear answers to the research questions posed above. Within the context of the thesis, the following analyses were utilised: i) Hexavalent and total chromium, ii) Chemical oxygen demand, iii) Nitrate and nitrite, iv) Sulfate and sulfides, v) Divalent iron, vi) Volatile fatty acids and vii) Fluorescent in-situ hybridization. Also, kinetic models were used to quantitatively describe the studied hexavalent chromium reduction cases.The results of the microcosm experiments can be summarized in the following conclusions. The reduction kinetics of hexavalent chromium can be quantitatively described by the pseudo-first-order kinetic model. Biostimulation by the addition of an organic electron donor can increase the rate of Cr(VI) reduction up to six times in comparison to the natural soil capacity rates under anaerobic conditions. Furthermore, a combination of organic carbon and iron electron donors can further increase the removal rate of hexavalent chromium through biotic and abiotic processes. Cr(VI) reduction is also feasible in the presence of nitrate ions and, according to the microcosm results, is carried out almost simultaneously with denitrification when electron donors are available. Microbes that have been acclimatized under anoxic conditions can completely mitigate water containing Cr(VI) and NO3-N concentrations, equal to 3 mg/L and 20 mg/L, respectively, through biostimulation, employing either an organic or a combination of organic and inorganic electron donors. Sulfate presence in a Cr(VI)-contaminated aquifer significantly improves microbially induced Cr(VI) reduction, even without the addition of an electron donor. However, at high sulfate concentrations (400 mg/L), Cr(VI) bioreduction is slightly impaired compared to lower sulfate concentrations (100 mg/l) due to the faster consumption of the organic electron donor. These results have been better elucidated with the use of mathematical equations. In order to describe the different cases of Cr(VI) reduction studied in the soil column experiments, the 1st order kinetic model with a modification was used. At the same time, an equation was constructed which can describe the reduction of Cr(VI) in saturated aquifers, taking into account the porosity of the polluted area. By conducting the soil column experiments it was proven that natural soil attenuation in the studied Cr-contaminated aquifer was low and was significantly exceeded by the amount of Cr(VI) in contaminated groundwater. Addition of organic electron donors can increase the Cr(VI) reduction rate up to 20 times in comparison to the natural soil capacity rates. Ferrous iron has low mobility in soil and groundwater with a pH close to 8 and is rendered passive quickly, leading to insignificant Cr(VI) removal. Combined biotic-abiotic Cr(VI) removal exhibited a longer-life span in the remediation of Cr(VI)-contaminated groundwater in comparison to biotic processes. Since anaerobic, anoxic, and sulfate-reducing conditions are quite common in groundwater aquifers, the findings of this study provide significant information on Cr(VI) bioreduction under these redox conditions through biostimulation and could be used as a basis for a possible larger-scale application for bioremediation purposes.

Κύριο αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη της αναγωγής του εξασθενούς χρωμίου (Cr+6) σε τρισθενές (Cr+3) μέσω της βιολογικής δράσης μικροβιακών κοινοτήτων, ως τρόπος επί τόπου αποκατάστασης υπόγειων υδροφορέων ρυπασμένων με εξασθενές χρώμιο. Οι μικροοργανισμοί έχουν τη δυνατότητα να απομακρύνουν πολλούς ρυπαντές από το περιβάλλον με ποικίλες ενζυματικές διεργασίες. Στο περιβάλλον, η αναγωγή του Cr(VI) στο λιγότερο τοξικό Cr(III) βασίζεται στην κινητική της αντίδρασης ανταγωνιστικών μικροβιακών και χημικών αντιδράσεων. Στους κοινούς χημικούς αναγωγείς του Cr(VI) περιλαμβάνονται σουλφίδια, οργανικές ενώσεις, διαλυτός Fe(II) και ορυκτά που περιέχουν Fe(II). Πολλοί μικροοργανισμοί έχουν δείξει την ικανότητα της άμεσης αναγωγής του Cr(VI) σε Cr(III) είτε αερόβια είτε αναερόβια. Ωστόσο, λίγες μελέτες έχουν μελετήσει τη δυνατότητα της επιτόπιας μικροβιακής αναγωγής σε υδροφόρους ορίζοντες. Υπό συνθήκες απουσίας οξυγόνου, τα βακτήρια μπορούν να χρησιμοποιήσουν κατευθείαν το Cr(VI) ως τελικό δέκτη ηλεκτρονίων ή να το ανάγουν στον περιπλασματικό χώρο. Επιπλέον, η αναγωγή του Cr(VI) μπορεί να πραγματοποιηθεί και έμμεσα από τη βακτηριακή δραστηριότητα, μέσω μεταβολικών τους παραπροϊόντων. Παράλληλα, μελέτες έχουν αποδείξει ότι τα ιδιαίτερα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της ρυπασμένης περιοχής - pH, θερμοκρασία, άλλες τοξικές ουσίες ή διαφορετικοί αποδέκτες ηλεκτρονίων (νιτρικό άζωτο, θειικά ιόντα)- μπορούν να επηρεάσουν την αποτελεσματικότητα της μικροβιακής αναγωγής.Με βάση τα ανωτέρω, στην παρούσα διατριβή τέθηκαν οι ακόλουθοι στόχοι: i) η διερεύνηση της επίδρασης του αποδέκτη ηλεκτρονίων στις μικροβιακές κοινότητες που ανάγουν το Cr(VI) υπό ανοξικές, αναερόβιες και διαφορετικές θειικοαναγωγικές συνθήκες, ii) η αξιολόγηση της επίδρασης συνδυασμού δοτών ηλεκτρονίων (πηγών οργανικού άνθρακα και σιδήρου) στην πλήρως αναερόβια ή ανοξική αναγωγή του εξασθενούς χρωμίου με παράλληλη αναγωγή νιτρικών ιόντων, καθώς και στην αναγωγή του Cr(VI) παρουσία θειικών ιόντων και iii) η διερεύνηση των σχετικών με την αναγωγή του Cr(VI) χημικών και βιοχημικών διεργασιών που επικρατούν σε έναν υπόγειο υδροφορέα, λαμβάνοντας υπόψη την κίνηση και μεταφορά του ρύπου μέσα στους πόρους του υπεδάφους. Πραγματοποιήθηκαν δύο είδη πειραμάτων, πειράματα μικρόκοσμου (ή πειράματα ασυνεχούς τροφοδοσίας, batch) και εδαφικών στηλών (ή πειράματα συνεχούς ροής), με στόχο την πληρέστερη προσομοίωση των συνθηκών που επικρατούν σε ένα υπόγειο υδροφορέα. Για την πραγματοποίηση των πειραμάτων μικρόκοσμου, αναπτύχθηκαν οι κατάλληλες βιοκοινότητες με ικανότητα αναγωγής του εξασθενούς χρωμίου. Συνολικά, αναπτύχθηκαν στο εργαστήριο τέσσερεις (4) μητρικές καλλιέργειες που τροφοδότησαν τους μικρόκοσμους με βιομάζα, έδαφος και υπόγειο νερό, σύμφωνα με τις τέσσερεις (4) οξειδοαναγωγικές συνθήκες που μελετήθηκαν (πλήρως αναερόβιες, παρουσία νιτρικών και δύο διαφορετικών συγκεντρώσεων θειικών ιόντων). Οι καλλιέργειες δημιουργήθηκαν σε γυάλινους περιέκτες, που έκλειναν αεροστεγώς. Σε αυτούς προστέθηκαν 1600 mL νερό γεώτρησης και 400 g ξηρό έδαφος (αναλογία 1:4). Ο εμπλουτισμός κάθε καλλιέργειας με βιομάζα έγινε στην αρχή της περιόδου εγκλιματισμού με την προσθήκη 30 mgTSS/L ενεργού ιλύος από αναερόβιο αντιδραστήρα. Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, όλες οι καλλιέργειες εκτέθηκαν σε χαμηλή συγκέντρωση εξασθενούς χρωμίου (0.5 mg/L) και διαφορετικούς αποδέκτες ηλεκτρονίων (κανέναν, 10 mg/L NO3-N, 100 mg/L SO42- και 400 mg/L SO42-). Μετά το πέρας της περιόδου εγκλιματισμού, ελάχιστης διάρκειας 4.5 μηνών, βιομάζα από τις μητρικές καλλιέργειες χρησιμοποιήθηκε για τα πειράματα batch, όπου διερευνήθηκε η επίδραση διαφορετικών τρόπων βιοδιέγερσης με την προσθήκη οργανικών ή ανόργανων δοτών ηλεκτρονίων ή και συνδυασμό αυτών.Τα πειράματα στηλών πραγματοποιήθηκαν υπό αναερόβιες συνθήκες, χρησιμοποιώντας δύο (2) στήλες από plexiglass, οι οποίες πληρώθηκαν με εδαφικό υλικό. Οι στήλες του εδάφους λειτουργούσαν υπό κορεσμένες συνθήκες με τους πόρους τους γεμάτους με νερό και τροφοδοτήθηκαν με διάλυμα Cr(VI) που παρασκευάστηκε με διηθημένο υπόγειο νερό και διχρωμικό κάλιο (K2Cr2O7). Η έξοδος κάθε στήλης ανακυκλοφορούσε στο δοχείο τροφοδοσίας, προκειμένου να προσομοιώσει καλύτερα τις συνθήκες σε έναν υπόγειο υδροφορέα και την ταχύτητα ροής του. Μελετήθηκαν: i) η φυσική αναγωγική ικανότητα του εδάφους χωρίς την προσθήκη δότη ηλεκτρονίων, ii) η αβιοτική αναγωγή του Cr(VI) με τη χρήση δισθενούς σιδήρου, iii) η βιολογική αναγωγή του Cr(VI) με τη χρήση πηγών οργανικού άνθρακα και iv) η συζευγμένη αβιοτική-βιοτική αναγωγή του Cr(VI) μέσω πιθανής αναγέννησης Fe(II) λόγω προσθήκης οργανικών πηγών άνθρακα.Δείγματα συλλέγονταν περιοδικά από τις μητρικές καλλιέργειες, τα πειράματα ασυνεχούς τροφοδοσίας και τα πειράματα στηλών, για τη διεξαγωγή αναλύσεων που οδήγησαν σε σαφείς απαντήσεις στα ερευνητικά ερωτήματα που τέθηκαν ανωτέρω. Επίσης, χρησιμοποιήθηκαν κινητικά μοντέλα για την ποσοτική περιγραφή των διαφορετικών περιπτώσεων αναγωγής του εξασθενούς χρωμίου που εξετάστηκαν.Τα αποτελέσματα από τα πειράματα μικρόκοσμου κατέδειξαν ότι οι διάφορες περιπτώσεις αναγωγής του Cr(VI) περιγράφονται ικανοποιητικά βάσει του μοντέλου κινητικής ψευδό-πρώτης τάξης. Υπό αναερόβιες συνθήκες, η βιοδιέγερση των μικροοργανισμών με την προσθήκη ενός οργανικού δότη ηλεκτρονίων μπορεί να αυξήσει τον ρυθμό αναγωγής του Cr(VI) έως και έξι φορές σε σύγκριση με τη φυσική αναγωγική ικανότητα του εδάφους. Επιπλέον, συνδυασμός οργανικού δότη ηλεκτρονίων και πηγής σιδήρου μπορεί να αυξήσει περαιτέρω τον ρυθμό απομάκρυνσης του εξασθενούς χρωμίου μέσω βιοτικών και αβιοτικών διεργασιών. Η αναγωγή του Cr(VI) είναι επίσης εφικτή παρουσία νιτρικών ιόντων και, σύμφωνα με τα αποτελέσματα των πειραμάτων, πραγματοποιείται σχεδόν ταυτόχρονα με την απονιτροποίηση, όταν υπάρχουν διαθέσιμοι δότες ηλεκτρονίων. Οι μικροοργανισμοί που έχουν εγκλιματιστεί υπό ανοξικές συνθήκες μπορούν να «καθαρίσουν» πλήρως το νερό που περιέχει συγκεντρώσεις Cr(VI) και NO3-N, ίσες με 3 mg/L και 20 mg/L, αντίστοιχα, μέσω βιοδιέγερσης, χρησιμοποιώντας είτε οργανικούς είτε συνδυασμό οργανικών και ανόργανων δοτών ηλεκτρονίων. Η παρουσία θειικών ιόντων σε υδροφόρο ορίζοντα ρυπασμένο με Cr(VI) βελτιώνει σημαντικά τη βιοχημική αναγωγή του Cr(VI), ακόμη και χωρίς την προσθήκη δότη ηλεκτρονίων. Ωστόσο, σε υψηλές συγκεντρώσεις θειικών (400 mg/L), η βιολογική αναγωγή του Cr(VI) είναι ελαφρώς μειωμένη σε σύγκριση με χαμηλότερες συγκεντρώσεις θειικών (100 mg/L) λόγω της ταχύτερης κατανάλωσης του οργανικού δότη ηλεκτρονίων. Οι ρυθμοί που προέκυψαν από τα πειράματα μικρόκοσμου συσχετίστηκαν μεταξύ τους με μαθηματικές σχέσεις.Για την περιγραφή των ανωτέρω φαινομένων που μελετήθηκαν στα πειράματα εδαφικών στηλών, χρησιμοποιήθηκε κατάλληλα τροποποιημένο μοντέλο κινητικής 1ης τάξης. Παράλληλα, αναπτύχθηκε κατάλληλη μαθηματική σχέση για την περιγραφή της αναγωγής του Cr(VI) σε κορεσμένους υδροφορείς, λαμβάνοντας υπόψη το πορώδες της περιοχής αποκατάστασης. Μέσω των πειραμάτων εδαφικών στηλών αποδείχτηκε ότι η φυσική αναγωγική ικανότητα του εδάφους είναι πολύ χαμηλή και δεν επαρκεί για την πλήρη απορρύπανση υδροφορέων με υψηλή περιεκτικότητα σε εξασθενές χρώμιο. Η προσθήκη οργανικών δοτών ηλεκτρονίων μπορεί να αυξήσει τον ρυθμό αναγωγής του Cr(VI) έως και 20 φορές σε σύγκριση με τους φυσικούς ρυθμούς αναγωγής Cr(VI) του εδάφους. Επιπλέον, φάνηκε ότι ο δισθενής σίδηρος έχει χαμηλή κινητικότητα σε έδαφος και υπόγεια ύδατα με pH κοντά στο 8 και παθητικοποιείται γρήγορα, οδηγώντας σε μικρή απομάκρυνση του Cr(VI). Η συνδυασμένη βιοτική-αβιοτική απομάκρυνση Cr(VI) είχε μεγαλύτερη διάρκεια ζωής στην αποκατάσταση των ρυπασμένων με Cr(VI) υπόγειων υδάτων σε σύγκριση με τη βιοτική διεργασία. Συνολικά, τα ευρήματα αυτής της μελέτης μπορούν να παράσχουν μια σημαντική βάση για τη βιολογική αποκατάσταση των υπόγειων υδάτων που έχουν ρυπανθεί με Cr(VI) υπό διαφορετικά οξειδοαναγωγικά περιβάλλοντα, σημαντικές πληροφορίες για την επιτόπια βιοαποκατάσταση ελλείψει οξυγόνου μέσω βιοδιέγερσης των μικροοργανισμών, καθώς και δεδομένα για τη μακροζωία της διαδικασίας όταν ο δότης ηλεκτρονίων είναι περιοριστικός παράγοντας.