Τεχνολογικές και βιο-ιατρικές εφαρμογές μαγνητικών νανοδομών

Abstract

The battle against cancer is not an easy task, due to the complexity and great heterogeneity of this disease. However, with the contribution of nanotechnology that has been increasing in recent years, it is possible to effectively deal with it. Magnetically activated treatments, which are already at the stage of clinical trials or medical practice, may compete with or complement the decades-long established treatments, such as chemotherapy and radiation therapy, with the aim of increasing the therapeutic efficiency and at the same time minimizing the side effects of these invasive treatments. The combination of magnetic fields and magnetic nanoparticles (MNPs) is already used in diagnosis (MRI contrast agents), therapy (drug deposition, magnetic hyperthermia) and manipulation of cancerous tissues (biolabeling, bioseparation). The magnetic fields used penetrate biological tissues and are safe for humans. The same situation prevails in the case of MNPs, which easily penetrate many kinds of biological pathways and are also, safe for humans. Thus, magnetic nanoparticle hyperthermia (MPH) is one of the most interesting treatment methods that involves the local heating of tumors and cancer cells, in the temperature range of 41-45 °C, through MNPs that release heat, after their exposure to an alternating magnetic field.In recent years, in the fight against cancer, much attention is also shifting to the magneto-mechanical action of nanoparticles, that induce static or time-varying magnetic fields, in the absence of heat. More specifically, mechanical forces generated through magnetic fields "manipulate" magnetic nanoparticles (MNPs), within variable environments. Electromagnetic energy is converted into mechanical energy, by combining various types of fields, (such as static, pulsed, alternating, rotating) of very low frequencies, with MNPs, allowing them to function and bind specifically to cell membranes (malignant and non-malignant), destroying, only the cancerous tissues. Magnetic stress through MNPs and the induced apoptotic death of cancer cells has already been studied in specially designed setups, where permanent magnets or electromagnets are used to produce controlled field gradients applied to MNPs incubated in cancer cell cultures.In this thesis, the objective is the thermal and mechanical activation of magnetic nanoparticles (MNPs), as cancer treatment strategies, under the influence of magnetic fields. However, side effects such as Eddy currents occur during MPH, which cause discomfort to patients and energy losses, an important factor, limiting the performance of MPH, in clinical trials. Therefore, the primary objective of this thesis is to minimize the unwanted heating of healthy tissues, without sparing the therapeutic ability of MNPs to effectively treat the tumor area. To achieve this goal, two alternative magnetic hyperthermia protocols are proposed, on the one hand using an intermittently applied alternating magnetic field instead of a continuous alternating magnetic field and on the other hand with the relative movement of the field toward the sample, through a motion-table. These two alternative ways of conducting MPH are examined not only separately, but also in combination, as well, in order to accomplish an even greater reduction of these healthy tissues side effects.To simulate the cancerous and healthy tissues, agarose phantoms were synthesized in the presence and absence of MNPs, respectively. The MNPs used are made of iron oxides (Fe3O4), as they are widely used, due to their biocompatibility, functionality and specific magnetic properties both in the treatment and in the diagnosis of various diseases. These MNPs were developed in the laboratory by the aqueous co-precipitation method and structural, morphological and magnetic characterization was carried out. For a more complete picture and a deeper understanding of the response of a real animal tissue, the same protocol was implemented in ex vivo measurements.In a subsequent stage, the magneto-mechanical stress of cancerous and healthy breast cells is studied, applying various types of field modes, such as static, pulsed and rotating, at very low frequencies, intending to reduce the viability, only in cancerous cells. With the help of fluorescent dyes and confocal microscopy, the alterations suffered by the cytoskeleton and the nucleus of the cells after a magneto-mechanical treatment, are recorded. The MNPs used in this research are starch coated iron oxides, commercial nanoparticles. Therefore, the final stage of this PhD thesis and the main research question it poses, concerns the combination of thermal and mechanical therapy, in order to investigate the cumulative effect of these two approaches on the destruction of breast cancer cells, through MNPs stimulation by magnetic fields.

Η μάχη κατά τον καρκίνο δεν είναι εύκολη υπόθεση, λόγω της πολυπλοκότητας και της μεγάλης ετερογένειας που αυτή η νόσος παρουσιάζει. Ωστόσο, με την συμβολή της νανοτεχνολογίας που ολοένα και αυξάνεται τα τελευταία χρόνια είναι δυνατή η αποτελεσματική αντιμετώπιση του. Μαγνητικά ενεργοποιημένες θεραπείες, που βρίσκονται ήδη στο στάδιο των κλινικών δοκιμών ή της ιατρικής πράξης, είναι δυνατόν να ανταγωνιστούν τις εδώ και δεκαετίες καθιερωμένες θεραπείες, τη χημειοθεραπεία και την ακτινοθεραπεία ή να δράσουν συμπληρωματικά προς αυτές, με στόχο την αύξηση της θεραπευτικής απόδοσης και την ταυτόχρονη μείωση των παρενεργειών, αυτών των επεμβατικών θεραπειών. Ο συνδυασμός μαγνητικών πεδίων και μαγνητικών νανοσωματιδίων (ΜΝΣ) χρησιμοποιείται ήδη στη διάγνωση (σκιαγραφικοί παράγοντες MRI), στη θεραπεία (απόθεση φαρμάκων, μαγνητική υπερθερμία) και στον χειρισμό καρκινικών ιστών (βιοσήμανση, βιοδιαχωρισμός). Τα μαγνητικά πεδία που χρησιμοποιούνται διαπερνούν βιολογικούς ιστούς και είναι ασφαλή για τον άνθρωπο. Το ίδιο συμβαίνει και με τα ΜΝΣ, τα οποία διαπερνούν εύκολα πολλών ειδών βιολογικές διαδρομές και είναι επίσης, ασφαλή για τον άνθρωπο. Έτσι, η μαγνητική υπερθερμία νανοσωματιδίων (ΜΥΝ) αποτελεί μια από τις πιο ενδιαφέρουσες μεθόδους θεραπείας, η οποία στοχεύει στη τοπική θέρμανση των όγκων και των καρκινικών κυττάρων, στο θερμοκρασιακό εύρος 41-45 οC, μέσω ΜΝΣ που εκλύουν θερμότητα, όταν αυτά εκτεθούν σε εναλλασσόμενο μαγνητικό πεδίο.Τα τελευταία χρόνια, στη μάχη κατά του καρκίνου, ιδιαίτερη προσοχή δίνεται και στη μαγνητο-μηχανική δράση νανοσωματιδίων που προκαλούν στατικά ή χρονικά μεταβαλλόμενα μαγνητικά πεδία, απουσία θερμότητας. Πιο συγκεκριμένα, μηχανικές δυνάμεις που δημιουργούνται μέσω μαγνητικών πεδίων "χειραγωγούν" τα μαγνητικά νανοσωματίδια (ΜΝΣ), μέσα σε μεταβλητά περιβάλλοντα. Η ηλεκτρομαγνητική ενέργεια μετατρέπεται σε μηχανική ενέργεια, συνδυάζοντας διάφορους τύπους πεδίων, (όπως στατικό, παλμικό, εναλλασσόμενο, περιστρεφόμενο), πολύ χαμηλών συχνοτήτων, με ΜΝΣ, επιτρέποντάς τα να λειτουργούν και να συνδέονται ειδικά με κυτταρικές μεμβράνες (κακοήθεις και μη), καταστρέφοντας μόνο τους καρκινικούς ιστούς. Η μαγνητική καταπόνηση μέσω ΜΝΣ και ο επαγόμενος αποπτωτικός θάνατος των καρκινικών κυττάρων έχει ήδη μελετηθεί σε ειδικά σχεδιασμένες διατάξεις, όπου μόνιμοι μαγνήτες ή ηλεκτρομαγνήτες χρησιμοποιούνται για την παραγωγή ελεγχόμενων βαθμίδων πεδίου που εφαρμόζονται σε ΜΝΣ επωασμένα σε καρκινικές κυτταρικές καλλιέργειες.Στη παρούσα διδακτορική διατριβή λοιπόν, στόχος είναι η θερμική και μηχανική ενεργοποίηση μαγνητικών νανοσωματιδίων (ΜΝΣ) ως στρατηγικές αντιμετώπισης του καρκίνου, υπό την επίδραση μαγνητικών πεδίων. Ωστόσο, κατά τη ΜΥΝ εμφανίζονται ανεπιθύμητα ρεύματα Eddy, τα οποία προκαλούν δυσφορία στους ασθενείς και απώλειες ισχύος αποτελώντας σημαντικό παράγοντα που περιορίζει την απόδοση της ΜΥΝ, σε κλινικές δοκιμές. Επομένως, πρωταρχικός στόχος της συγκεκριμένης διατριβής είναι η ελαχιστοποίηση της ανεπιθύμητης θέρμανσης των υγιών ιστών, χωρίς να περιορίζεται η θεραπευτική ικανότητα των ΜΝΣ, για αποτελεσματική θεραπεία της προβληματικής περιοχής. Για την επίτευξη αυτού του στόχου προτείνονται δύο εναλλακτικά πρωτόκολλα μαγνητικής υπερθερμίας, αφενός με τη χρήση διακοπτόμενα εφαρμοζόμενου εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου αντί συνεχόμενου εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου και αφ’ ετέρου με την σχετική κίνηση του πεδίου ως προς το δείγμα, μέσω μιας τράπεζας - κίνησης. Οι δύο αυτοί εναλλακτικοί τρόποι διεξαγωγής της ΜΥΝ, εξετάζονται και χωριστά, αλλά και συνδυαστικά με σκοπό την ακόμη μεγαλύτερη μείωση των παρενεργειών αυτών στους υγιείς ιστούς.Για τη προσομοίωση των καρκινικών και υγιών ιστών συντέθηκαν ομοιώματα αγαρόζης παρουσία και μη ΜΝΣ, αντίστοιχα. Τα ΜΝΣ που χρησιμοποιούνται είναι από οξείδια του σιδήρου (Fe3O4), καθώς χρησιμοποιούνται ευρέως, λόγω της βιοσυμβατότητας, της λειτουργικότητας και των ιδιαίτερων μαγνητικών τους ιδιοτήτων, τόσο στη θεραπεία, όσο και στη διάγνωση διαφόρων ασθενειών. Τα ΜΝΣ αυτά, αναπτύχθηκαν στο εργαστήριο με τη μέθοδο της υδατικής συγκαταβύθισης και πραγματοποιήθηκε δομικός, μορφολογικός και μαγνητικός χαρακτηρισμός. Για μια πιο ολοκληρωμένη εικόνα και βαθύτερη κατανόηση της ανταπόκρισης ενός πραγματικού ζωικού ιστού, το ίδιο πρωτόκολλο υλοποιήθηκε και σε ex vivo μετρήσεις.Σε επόμενο στάδιο, μελετάται η μαγνητο-μηχανική καταπόνηση καρκινικών και υγιών κυττάρων του μαστού, εφαρμόζοντας διάφορους τύπους πεδίου, όπως στατικό, παλμικό και περιστρεφόμενο, σε πολύ χαμηλές συχνότητες με στόχο τη μείωση της βιωσιμότητας, μόνο των καρκινικών κυττάρων. Με τη βοήθεια φθορίζουσων χρωστικών και της συνεστιακής μικροσκοπίας, αποτυπώνονται οι αλλοιώσεις που έχουν υποστεί ο κυτταροσκελετός και ο πυρήνας των κυττάρων, ύστερα από μία μαγνητο-μηχανική θεραπεία. Τα ΜΝΣ που χρησιμοποιούνται και σε αυτήν την έρευνα είναι από οξείδια του σιδήρου, εμπορικά και επικαλυμμένα με άμυλο. Επομένως, το τελευταίο στάδιο αυτής της διδακτορικής διατριβής και το κύριο ερευνητικό ερώτημα που θέτει, αφορά το συνδυασμό της θερμικής και της μηχανικής θεραπείας, ώστε να διερευνηθεί η αθροιστική επίδραση των δύο αυτών προσεγγίσεων στην καταστροφή των καρκινικών κυττάρων του μαστού, μέσω της διέγερσης ΜΝΣ από μαγνητικά πεδία.