Αυτοφαγία και κυτταρική γήρανση ως μηχανισμοί απόκρισης στο οξειδωτικό στρες: λειτουργική συσχέτιση με το μηχανισμό της διατήρησης της χρωμοσωμικής σταθερότητας

Abstract

Oxidative stress (OS) has been linked to cellular senescence as well as to etiopathology of many diseases including age-related diseases, such as osteoarthritis. Both OS and cellular senescence have been associated with autophagy, although studies demonstrate the dual role of autophagy, with data supporting its role in both inhibiting and inducing cellular senescence. Furthermore, studies from our laboratory and others have shown that the establishment of cellular senescence is accompanied by genomic instability, which is evident by various features such as aneuploidy or mitotic errors.In the first part of this thesis, chondrocytes from healthy donors and patients with osteoarthritis were used. Comparison between osteoarthritic and normal chondrocytes was carried out regarding cellular senescence markers. Protein levels of p16, a known cell cycle inhibitor and characteristic biomarker of cellular senescence, were calculated under normal culture conditions. We also analyzed the total load of free radicals (Reactive Oxygen Species - ROS), the levels of superoxide as well the transcriptional levels of iNOS, an enzyme mainly responsible for the generation of RNS (Reactive Nitrogen Species). Oxidative DNA damage was quantified using antibodies against oxidized deoxyguanosine (8-oxo-dG). We then treated normal and osteoarthritic chondrocytes with hydrogen peroxide (H2O2), let them recover for different time points and analyzed the levels of DNA damage by immunofluorescence microscopic analysis with an antibody against histone H2AX phosphorylated at serine 139 (γH2AX) and 53BP1, two characteristic markers of DNA double-strand breaks. The analysis aimed to reveal whether the already increased oxidative load of osteoarthritic chondrocytes leads to an inability to repair the damage in the DNA due to the exogenous oxidative insult. Then, under the same conditions and via confocal microscopy, mitochondria morphology was analyzed, in order to highlight a possible correlation between the inability to respond to oxidative stress with the imbalance between fission and fusion, that is reflected with morphology changes in the mitochondrial network. Finally, a marker of senescent cells, the formation of micronuclei, was analyzed under normal culture conditions and after 1 hour and 24 hours of recovery time from the exogenous oxidative insult. This was followed by a study of the ability of normal and osteoarthritic chondrocytes to induce autophagy in response to the oxidative insult. Transcriptional levels of key autophagy genes (ATG5, Beclin-1, LC3) were assessed by qRT-PCR a) under normal culture conditions and b) after exposure to H2O2 and recovery for different time periods. In the same conditions, the protein levels of autophagy markers were also assessed, and immunofluorescence was also performed against the key marker protein of the autophagic response, LC3, in order to observe the formation of autophagosomes. Finally, in an effort to detect a possible key molecule for the regulation of the autophagic response against the OS, we aimed at studying a known regulator of autophagy and in the same time, according to a recent study, a selective substrate of autophagy upon senescence and ageing, SIRT1. We performed treatment of chondrocytes with hydroxychloroquine (HCQ) (a drug that prevents the fusion of autophagosomes with lysosomes) and co-immunoprecipitation with LC3 in order to test the selective degradation of SIRT1 by autophagy.The results of the above experiments showed that osteoarthritic chondrocytes show characteristics of senescent cells, such as increased protein levels of p16, increased levels of ROS, and changes in the mitochondrial network that leads to additional production of ROS, which is probably responsible for the observed increased DNA damage lesions. In addition, osteoarthritic chondrocytes were found to be unable to respond to exogenous oxidative insult and repair damage onto DNA. Also, osteoarthritic chondrocytes showed reduced transcriptional levels of key autophagy molecules as well as temporal dysregulation of the autophagic response to exogenous oxidative insult. Finally, SIRT1 was found to be selectively degraded by autophagy in osteoarthritic chondrocytes, as it has been shown for senescent cells.Based on all the above, we formulated the following proposal regarding the relationship oxidative stress-senescence-autophagy in OA chondrocytes. In the second part of this thesis, mesenchymal stem cells were isolated from Wharton's jelly (WJ-MSCs) from 3-6 donors and were cultured until they reached senescence, which occurred either naturally due to successive cell divisions (replicative senescence) or prematurely, induced by exogenous oxidative stress (stress induced premature senescence – SIPS). First, comparison between young (early passage), middle-aged (middle passage) and senescent (late passage) stem cells was carried out regarding senescence markers. B-galactosidase activity, protein levels of the cell cycle inhibitors p16 and p21 were assayed, while immunofluorescence microscopy was performed to analyze total ROS as well as superoxide levels under normal conditions. In addition, DNA damage was estimated in young and senescent cells under normal culture conditions and also after exposure to hydrogen peroxide (H2O2) and recovery for different time periods (1h and 24h), using antibodies against 53BP1 and γH2AX. Under the same conditions, the morphology of the mitochondrial network was also analyzed. An earlier study by our group, as well as others, has linked oxidative stress to spindle assembly checkpoint (SAC) dysfunction and subsequent genomic instability, and so to further analyze this relationship, a series of experiments were performed: Rates of mitotic errors, centrosome number, and centrosome-related dysfunctions of young and senescent cells, as well as young cells exposed to H2O2 were calculated. The appearance of lagging chromosomes and chromatin bridges were also assessed. Then we treated young, senescent cells and young cells pretreated with H2O2 with paclitaxel, -a known microtubule poison that leads to cell cycle arrest during mitosis if SAC is functional-, and we calculated the percentage of cells that remained in mitosis after 16h. Protein and transcriptional levels of SAC basic molecules, such as of Bub1b/BubR1, a key molecule of the mitotic checkpoint complex (MCC), were also assessed during senescence of mesenchymal stem cells and also in tissues of young, middle-aged and old mice. The amount of Mad2 and Bub1b/BubR1 that co-immunoprecipitated with CDC20 (central molecules of the MCC) in young stem cells and young stem cells pretreated with H2O2 was also calculated. CDC20 immunoprecipitation was also performed in the mitotic fraction from young and senescent stem cells after 16 hours in paclitaxel.As the previous section of the thesis showed dysregulation of the autophagic response in OA chondrocytes, but also because there is recent evidence linking senescence-related genomic instability to dysregulation of autophagy, we moved on to a more thorough study of autophagy and WJs-MSCs. In young and senescent WJ-MSCs, their autophagic response to exogenous oxidative insult was studied. Firstly, protein levels of key autophagy molecules were calculated in young (early passage), middle-aged (middle passage), senescent (late passage) stem cells and also in cells with stress induced premature senescence (SIPS). We then analyzed the protein levels of key autophagy molecules in young and senescent WJ-MSCs subjected to exogenous oxidative insult. In addition, we silenced the key autophagy molecule ATG5 and then analysed the induction of cellular senescence, the level of mitotic defects as well as number of cells with supernumerary centrosomes. We also isolated the mitotic fractions of young and senescent WJ-MSCs and estimated the levels of autophagic proteins. Since autophagy has been shown to be suppressed in normal cells during mitosis in order to protect DNA from degradation, we aimed at analysing the autophagic activity during mitosis by estimating the ATG13/ULK1 interaction, as well as the Beclin-1/PI3K-CIII, -basic interactions between the key molecules of the autophagic pathway-by immunoprecipitation of ATG13 and Beclin-1 from young and senescent asynchronous cells and in young and senescent cells that were arrested in mitosis. Finally, we aimed at studying whether changes in Bub1b/BubR1 levels during cellular senescence and ageing might be controlled by autophagy. To analyze this possibility, we treated young and senescent stem cells with two inhibitors of autophagy that act at a different point of the process, HCQ and 3-Methyladenine (3MA), as well as with a known autophagy inducer, everolimus. In order to analyze whether Bub1b/BubR1 could be a substrate of autophagy, we also checked databases and prediction applications for the existence of a LIR motif in the molecule that could serve the interaction with ATG8 and is found in most known substrates of autophagy. In addition, it was tested whether it is a selective substrate of autophagy directly by a) co-immunoprecipitation of Bub1b/BubR1 with LC3 in young and senescent mesenchymal cells and in tissues of young and middle-aged mice and b) confocal immunofluorescence microscopy in order to check the colocalization of Bub1b/BubR1 with LC3.The results of the above experiments demonstrated changes in both protein and transcriptional levels of SAC molecules and especially Bub1b/BubR1, that showed a characteristic pattern with an initial increase followed by a decrease during cellular senescence and ageing. In addition, dysregulation of the autophagic response against oxidative insult but also failure to suppress autophagy during mitosis was observed in senescent WJ-MSCs, further confirming the dysregulation of autophagy upon senescence. Changes in MCC formation were also observed, leading to a weakened SAC in senescent stem cells but also in young cells exposed to exogenous oxidative insult, as indicated by the increase in mitotic errors, supernumerary centrosomes and features associated with a dysfunctional SAC (micronuclei, abnormal spindles, inability for cell cycle arrest). Finally, our results demonstrated that autophagy is responsible for the decrease in the levels of the main SAC molecule, Bub1b/BubR1, during senescence.All of the above leads to our mechanistic proposal schematically described in figure 2: For the first time, to our knowledge, it is proposed that Bub1b/BubR1 is a selective autophagy substrate, preferentially upon senescence onset. Bub1b/BubR1 has previously been reported to decrease naturally with age. Here, we show that there is an initial increase in Bub1b/BubR1 levels, feasibly as part of the cells' response against genomic instability that results from SAC dysfunction due to OS. This initial increase is followed by its autophagy-dependent degradation. This provides an explanation for the downregulation of Bub1b/BubR1 upon ageing, especially since it is well established that proteasome function decays as cells age. These results not only serve the previously reported notion of a shift from proteasome to autophagy-dependent degradation upon ageing, but also suggest a mechanistic explanation for mitotic errors-driven senescence.We further believe that our findings deepen our understanding regarding the homeostatic function of autophagy that serves the establishment of cellular senescence as a barrier against cellular transformation.

Το οξειδωτικό στρες (ΟΣ) έχει συνδεθεί με την κυτταρική γήρανση καθώς και με την αιτιοπαθολογία πολλών ασθενειών συμπεριλαμβανομένων των ηλικιοεξαρτώμενων ασθενειών, όπως η οστεοαρθρίτιδα. Tόσο το ΟΣ όσο και η κυτταρική γήρανση έχουν συσχετιστεί με την αυτοφαγία, ωστόσο μελέτες καταδεικνύουν τη διττή φύση της αυτοφαγίας, με δεδομένα να υποστηρίζουν το ρόλο της τόσο στην αναστολή όσο και στην επαγωγή της κυτταρικής γήρανσης. Επιπλέον μελέτες του εργαστηρίου μας αλλά και άλλες έχουν δείξει ότι η εγκαθίδρυση της κυτταρικής γήρανσης συνοδεύεται από γενωμική αστάθεια, που είναι εμφανής μέσω διαφόρων χαρακτηριστικών όπως η ανευπλοειδία ή τα μιτωτικά λάθη. Στο πρώτο μέρος της συγκεκριμένης διατριβής χρησιμοποιήθηκαν χονδροκύτταρα από φυσιολογικούς και οστεοαρθριτικούς δότες. Αρχικά πραγματοποιήθηκε έλεγχος και σύγκριση των οστεοαρθριτικών με φυσιολογικά χονδροκύτταρα αναφορικά με δείκτες γήρανσης. Ελέγχθηκαν καταρχάς τα επίπεδα της πρωτεΐνης p16, γνωστού αναστολέα του κυτταρικού κύκλου και χαρακτηριστικού βιοδείκτη της γήρανσης, υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας. Αναλύθηκε επιπλέον το συνολικό φορτίο ελευθέρων ριζών ή δραστικών μορφών οξυγόνου (Reactive Oxygen Species-ROS) και τα επίπεδα του υπεροξειδίου (ρίζα του σουπεροξειδίου) καθώς και τα μεταγραφικά επίπεδα του iNOS, ενζύμου κύρια υπεύθυνου για τη δημιουργία δραστικών μορφών αζώτου (Reactive Nitrogen Species-RNS). Υπολογίστηκαν επιπλέον οι οξειδωτικές βλάβες στο DNA με την χρήση αντισωμάτων εναντίον της οξειδωμένης παραλλαγής της δεοξυγουανοσίνης (8-οξο-δεοξυγουανοσίνης-8-oxo-dG). Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε επιδράσεις επί φυσιολογικών και οστεοαρθριτικών χονδροκυττάρων με υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) και ανάκαμψη για διαφορετικά χρονικά διαστήματα και ανάλυση των επιπέδων των βλαβών στο DNA μέσω μικροσκοπικής ανάλυσης ανοσοφθορισμού με αντίσωμα εναντίον της φωσφορυλιωμένης στην σερίνη 139 ιστόνης H2AX (γH2AX) και του 53BP1, δύο χαρακτηριστικών δεικτών των θραύσεων της διπλής αλυσίδας. Η ανάλυση σκόπευε στο αναδείξει αν το ήδη αυξημένο οξειδωτικό φορτίο των οστεοαρθριτικών χονδροκυττάρων οδηγεί σε αδυναμία επιδιόρθωσής των βλαβών που δημιουργούνται στο DNA εξαιτίας της εξωγενούς οξειδωτικής προσβολής. Στη συνέχεια, κάτω από τις ίδιες συνθήκες και μέσω συνεστιακής μικροσκοπίας αναλύθηκε επιπλέον η μορφολογία των μιτοχονδρίων, προκειμένου να αναδειχθεί πιθανή συσχέτιση της αδυναμίας απόκρισης στο οξειδωτικό στρες με την ανισορροπία μεταξύ σχάσης και σύντηξης, που αντικατοπτρίζεται με αλλαγές στη μορφολογία του μιτοχονδριακού δικτύου. Τέλος, αναλύθηκε και ένα χαρακτηριστικό των γηρασμένων κυττάρων, ο σχηματισμός μικροπυρήνων, υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας και έπειτα από ανάκαμψη 1 ώρας και 24 ωρών από την επίδραση εξωγενούς οξειδωτικού στρες. Ακολούθησε μελέτη της ικανότητας επαγωγής της αυτοφαγίας στα οστεοαρθριτικά χονδροκύτταρα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά στην εξωγενή οξειδωτική προσβολή. Ελέγχθηκαν καταρχάς τα μεταγραφικά επίπεδα βασικών γονιδίων της αυτοφαγίας (ATG5, Beclin-1, LC3) μέσω qRT-PCR α) υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας και β) έπειτα από επιδράσεις με H2O2 και ανάκαμψη για διαφορετικά χρονικά διαστήματα. Στις ίδιες συνθήκες ελέγχθηκαν και τα πρωτεϊνικά επίπεδα δεικτών της αυτοφαγίας και πραγματοποιήθηκε ανοσοφθορισμός εναντίον της βασικής πρωτεΐνης δείκτη της αυτοφαγικής απόκρισης, LC3, προκειμένου να παρατηρήσουμε το σχηματισμό των αυτοφαγοσωμάτων. Τέλος, στην προσπάθεια ανίχνευσης ενός πιθανού μορίου-κλειδί για τη ρύθμιση της αυτοφαγικής απόκρισης απέναντι στο οξειδωτικό στρες οδηγηθήκαμε στη μελέτη ενός γνωστού ρυθμιστή της αυτοφαγίας αλλά και, σύμφωνα με πρόσφατη μελέτη, εκλεκτικού υποστρώματος της αυτοφαγίας κατά τη γήρανση, τη SIRT1. Πραγματοποιήσαμε επιδράσεις σε χονδροκύτταρα με υδροξυχλωροκίνη (HCQ) (παράγοντα που εμποδίζει την σύντηξη των αυτοφαγοσωμάτων με τα λυσοσώματα) και συν-κατακρήμνιση με το LC3 προκειμένου να ελέγξουμε την αποικοδόμηση της SIRT1 μέσω αυτοφαγίας. Τα αποτελέσματα των παραπάνω πειραμάτων έδειξαν ότι τα οστεοαρθριτικά χονδροκύτταρα εμφανίζουν χαρακτηριστικά γηρασμένων κυττάρων όπως αυξημένα πρωτεϊνικά επίπεδα του p16, αυξημένα επίπεδα ROS ενώ ταυτόχρονα εμφανίζουν και αλλαγές στο μιτοχονδριακό δίκτυο το οποίο οδηγεί σε επιπλέον παραγωγή οξειδωτικού στρες που πιθανά ευθύνεται για τις αυξημένες βλάβες στο γενετικό υλικό που παρατηρήθηκαν. Επιπρόσθετα βρέθηκε ότι τα οστεοαρθριτικά χονδροκύτταρα αδυνατούν να αποκριθούν στην εξωγενή οξειδωτική προσβολή και να επιδιορθώσουν τις βλάβες στο γενετικό υλικό. Επιπλέον τα οστεοαρθριτικά χονδροκύτταρα εμφάνισαν μειωμένα μεταγραφικά επίπεδα βασικών μορίων της αυτοφαγίας αλλά και χρονική απορρύθμιση της αυτοφαγικής απόκρισης στην εξωγενή οξειδωτική προσβολή. Τέλος βρέθηκε ότι η SIRT1 αποικοδομείται επιλεκτικά από την αυτοφαγία στα οστεοαρθριτικά χονδροκύτταρα, όπως έχει δειχθεί για γηρασμένα κύτταρα. Βάση όλων των ανωτέρων και των αποτελεσμάτων που προέκυψαν οδηγηθήκαμε στη διατύπωση της ακόλουθης πρότασης αναφορικά με τη σχέση οξειδωτικού στρες-γήρανσης-αυτοφαγίας στα ΟΑ χονδροκύτταρα. Στο δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής χρησιμοποιηθήκαν μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα από τη γέλη του Wharton (WJ-MSCs) από 3-6 δότες μέχρι τη γήρανση τους, η οποία επήλθε είτε φυσικά εξαιτίας των διαδοχικών διαιρέσεων (αναδιπλασιαστική γήρανση) είτε με πρόωρη επαγωγή της ως απόκριση στο εξωγενές οξειδωτικό στρες (stress induced premature senescence – SIPS). Αρχικά πραγματοποιήθηκε έλεγχος και σύγκριση των νεαρών (early passage) με τα μεσαίας ηλικίας (middle passage) και τα γηρασμένα (late passage) βλαστοκύτταρα αναφορικά με δείκτες γήρανσης. Ελέγχθηκε η ενεργότητα της β-γαλακτοσιδάσης, τα πρωτεϊνικά επίπεδα των αναστολέων του κυτταρικού κύκλου p16 και του p21 υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας, ενώ πραγματοποιήθηκε μικροσκοπία ανοσοφθορισμού προκειμένου να αναλύσουμε το συνολικό φορτίο των ελευθέρων ριζών (ROS) καθώς και τα επίπεδα του υπεροξειδίου υπό κανονικές συνθήκες. Επιπλέον υπολογίστηκαν οι βλάβες στο DNA σε νεαρά και γηρασμένα κύτταρα κάτω από κανονικές συνθήκες καλλιέργειας αλλά και έπειτα από επιδράσεις με υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) και ανάκαμψη για διαφορετικά χρονικά διαστήματα (1h και 24h) με τη χρήση αντισωμάτων εναντίον του 53BP1 και της γH2AX. Στις ίδιες συνθήκες αναλύθηκε και η μορφολογία του μιτοχονδριακού δικτύου. Μια παλιότερη μελέτη της ομάδας μας, καθώς και άλλων, έχει συσχετίσει το οξειδωτικό στρες με δυσλειτουργία του σημείου ελέγχου διαμόρφωσης της μιτωτικής ατράκτου (Spindle Assembly Checkpoint - SAC)-βασικού μηχανισμού διατήρησης της χρωμοσωμικής σταθερότητας-και την επακόλουθη γενωμική αστάθεια, και προκειμένου να αναλυθεί περαιτέρω αυτή η σχέση πραγματοποιηθήκαν μια σειρά πειραμάτων: Υπολογίστηκαν τα ποσοστά μιτωτικών βλαβών, καθώς και έλεγχος των κεντροσωμάτων και σχετιζόμενες με τα κεντροσώματα δυσλειτουργίες νεαρών και γηρασμένων κυττάρων, καθώς και νεαρών κυττάρων στα οποία έγινε επίδραση με H2O2 και ανάκαμψη για 48 ώρες. Επίσης υπολογίστηκε η εμφάνιση καθυστερημένων (lagging) χρωμοσωμάτων και η δημιουργία γεφυρών χρωματίνης. Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε επιδράσεις με ταξόλη, γνωστού δηλητηρίου των μικροσωληνίσκων που οδηγεί σε παύση του κυτταρικού κύκλου κατά τη μίτωση αν το SAC είναι λειτουργικό, σε νεαρά και γηρασμένα κύτταρα και σε νεαρά κύτταρα τα οποία είχαμε προηγουμένως επιδράσει με H2O2 και υπολογίστηκε το ποσοστό των κυττάρων που παρέμεινε στη μίτωση μετά από 16 ώρες. Έπειτα πραγματοποιήθηκε έλεγχος των πρωτεϊνικών και μεταγραφικών επιπέδων των βασικών μορίων του SAC καθώς και έλεγχος συγκεκριμένα των πρωτεϊνικών και μεταγραφικών επιπέδων του Bub1b/BubR1, βασικού μορίου του συμπλόκου του μιτωτικού σημείου ελέγχου (Mitotic checkpoint complex-MCC) κατά τη γήρανση των μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων αλλά και σε ιστούς νεαρών, μέσης ηλικίας και γηρασμένων ποντικών. Ελέγχθηκε επιπλέον η ποσότητα του Mad2 και του Bub1b/BubR1 που συν-ανοσοκατακρημνίζεται με το CDC20 (κεντρικά μόρια στο MCC) σε νεαρά βλαστοκύτταρα και νεαρά βλαστοκύτταρα στα οποία έχει προηγηθεί επίδραση με Η2Ο2. Πραγματοποιήθηκε και ανοσοκατακρήμνιση με το CDC20 στο μιτωτικό κλάσμα από νεαρά και γηρασμένα βλαστοκύτταρα έπειτα από 16 ώρες στην ταξόλη. Καθώς η προηγούμενη ενότητα της διατριβής έδειξε την απορρύθμιση της αυτοφαγικής απόκρισης σε ΟΑ χονδροκύτταρα (κύτταρα όπως είδαμε με γηρασμένο φαινότυπο), αλλά και επειδή υπάρχουν πρόσφατες ενδείξεις συσχέτισης της σχετιζόμενης με τη γήρανση γενωμικής αστάθειας με την απορρύθμιση της αυτοφαγίας, περάσαμε στην ενδελεχή μελέτη της αυτοφαγίας και στα WJ-MSCs. Σε νεαρά και γηρασμένα WJ-MSCs έγινε μελέτη της απόκριση τους μέσω αυτοφαγίας στην εξωγενή οξειδωτική προσβολή. Ελέγχθηκαν καταρχάς τα πρωτεϊνικά επίπεδα βασικών μορίων της αυτοφαγίας σε νεαρά (early passage) μεσαίας ηλικίας (middle passage), γηρασμένα (late passage) βλαστοκύτταρα αλλά και σε κύτταρα με πρόωρη επαγωγή της γήρανσης μέσω οξειδωτικής προσβολής (SIPS). Στη συνέχεια αναλύθηκαν τα πρωτεϊνικά επίπεδα των βασικών μορίων της αυτοφαγίας σε νεαρά και γηρασμένα WJ-MSCs τα οποία υποβλήθηκαν σε εξωγενές οξειδωτικό στρες και αφέθηκαν να ανακάμψουν για διαφορετικές χρονικές περιόδους. Επιπλέον πραγματοποιήσαμε αποσιώπηση του βασικού μορίου της αυτοφαγίας ATG5 και πραγματοποιήθηκε έλεγχος για την επαγωγή κυτταρικής γήρανσης, τη δημιουργία μιτωτικών βλαβών (mitotic defects) καθώς και για την ύπαρξη κυττάρων με υπεράριθμα κεντροσώματα. Επιπλέον απομονώσαμε το μιτωτικό κλάσμα και υπολογίσαμε τα επίπεδα των αυτοφαγικών πρωτεϊνών σε νεαρά και γηρασμένα WJ-MSCs. Δεδομένου ότι η αυτοφαγία έχει δειχθεί ότι καταστέλεται σε φυσιολογικά κύτταρα προκειμένου να προφυλαχθεί το γενετικό υλικό από τυχόν λανθασμένη αποικοδόμηση, θελήσαμε να ελέγξουμε τη δραστικότητα της αυτοφαγίας κατά τη μίτωση γηρασμένων WJ-MSC, αναλύοντας την αλληλεπίδραση ATG13/ULK1, καθώς και την αλληλεπίδραση Beclin-1/PI3K-CIII, βασικών αλληλεπιδράσεων των μορίων-κλειδιά του αυτοφαγικού μονοπατιού, πραγματοποιώντας ανοσοκατακρήμνιση του ATG13 και του Beclin-1 σε νεαρά και γηρασμένα ασύγχρονα κύτταρα και σε νεαρά και γηρασμένα κύτταρα που βρισκόντουσαν στη μίτωση. Τέλος, θελήσαμε να μελετήσουμε αν τυχόν αλλαγές στα επίπεδα του Bub1b/BubR1 κατά τη γήρανση μπορεί να ελέγχονται από την αυτοφαγία. Για να αναλύσουμε αυτό το ενδεχόμενο, επιδράσαμε σε νεαρά και γηρασμένα βλαστοκύτταρα με δύο αναστολείς της αυτοφαγίας που δρουν σε διαφορετικό σημείο της διαδικασίας, την HCQ και την 3-Μεθυλαδενινη (3-Methyladenine /3MA) καθώς και με έναν γνωστό επαγωγέα της αυτοφαγίας, το everolimus. Προκειμένου να αναλύσουμε αν το Bub1b/BubR1 θα μπορούσε να αποτελεί υπόστρωμα της αυτοφαγίας ελέγξαμε μέσω υπολογιστικών προγραμμάτων την ύπαρξη στο μόριο χαρακτηριστικού μοτίβου που εξυπηρετεί την αλληλεπίδραση με τις πρωτεΐνες ATG8 και βρίσκεται στα περισσότερα γνωστά υποστρώματα της αυτοφαγίας. Επιπλέον ελέγχθηκε αν αποτελεί εκλεκτικό υπόστρωμα της αυτοφαγίας άμεσα α) μέσω ανοσοκατακρήμνισης του με το LC3 σε νεαρά και γηρασμένα μεσεγχυματικά και σε ιστούς νεαρών και μέσης ηλικίας ποντικών και β) μέσω συνεστιακής μικροσκοπίας ανοσοφθορισμού προκειμένου να ελεγχθεί ο συνεντοπισμός του Bub1b/BubR1 με το LC3. Τα αποτελέσματα των παραπάνω πειραμάτων κατέδειξαν αλλαγές στα πρωτεϊνικά και μεταγραφικά επίπεδα των μορίων του SAC και κυρίως του Bub1b/BubR1, που εμφανίζει ένα χαρακτηριστικό πρότυπο με μια αρχική αύξηση που ακολουθείται από μείωση όταν τα κύτταρα ή τα ζώα αρχίζουν να γερνούν. Επιπλέον παρατηρήθηκε απορρύθμιση της αυτοφαγικής απόκρισης έναντι της οξειδωτικής προσβολής αλλά και αδυναμία καταστολής της αυτοφαγίας κατά τη μίτωση στα γηρασμένα WJ-MSC, επιβεβαιώνοντας περαιτέρω την απορρύθμιση της αυτοφαγίας κατά τη γήρανση. Παρατηρήθηκαν επίσης αλλαγές στο σχηματισμό του MCC, που οδηγούν σε ένα αποδυναμωμένο SAC στα γηρασμένα βλαστοκύτταρα αλλά και σε νεαρά κύτταρα είχαν δεχθεί την επίδραση εξωγενούς οξειδωτικού στρες, όπως υποδεικνύει η αύξηση στα μιτωτικά λάθη, τα υπεράριθμα κεντροσώματα και τα σχετιζόμενα με δυσλειτουργικό SAC χαρακτηριστικά (μικροπυρήνες, ανώμαλες άτρακτοι, αδυναμία παύσης του κυτταρικού κύκλου). Τέλος, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ότι για τη μείωση των επιπέδων του κεντρικού μορίου του SAC, Bub1b/BubR1, κατά τη γήρανση είναι η υπεύθυνη η αυτοφαγία. Όλα τα παραπάνω συνέβαλαν στη διαμόρφωση της πρότασης μας για τον υποκείμενο μηχανισμό, η οποία περιγράφεται σχηματικά στην εικόνα 2: Για πρώτη φορά, από όσο γνωρίζουμε, υποστηρίζεται ότι το Bub1b/BubR1 είναι εκλεκτικό υπόστρωμα της αυτοφαγίας κατά την έναρξη της γήρανσης. Το Bub1b/BubR1 έχει αναφερθεί στο παρελθόν ότι μειώνεται φυσικά με τη γήρανση. Εδώ, δείχνουμε ότι υπάρχει μια αρχική αύξηση στα επίπεδα του, πιθανώς ως μέρος της απόκρισης των κυττάρων έναντι της γενωμικής αστάθειας που προκύπτει ως αποτέλεσμα της δυσλειτουργίας του SAC λόγω ΟΣ. Η αρχική αυτή αύξηση ακολουθείται από την αποικοδόμησή του που εξαρτάται από την αυτοφαγία. Αυτό παρέχει μια εξήγηση για τη μείωση του κατά τη γήρανση, κυρίως επειδή είναι καλά αποδεδειγμένο ότι η λειτουργία του πρωτεασώματος μειώνεται καθώς τα κύτταρα γερνούν. Αυτά τα αποτελέσματα, όχι μόνο υποστηρίζουν την προηγουμένως αναφερθείσα άποψη της μετατόπισης της αποικοδόμησης που εξαρτάται από το πρωτεάσωμα προς την αυτοφαγία κατά τη γήρανση, αλλά, προτείνουν επίσης μια μηχανιστική επεξήγηση για τη γήρανση που προκαλείται από τα μιτωτικά λάθη. Πιστεύουμε επιπλέον ότι τα συμπεράσματά μας εμβαθύνουν την κατανόησή μας σχετικά με την ομοιοστατική λειτουργία της αυτοφαγίας που εξυπηρετεί την εγκαθίδρυση της κυτταρικής γήρανσης ως εμπόδιο ενάντια στον κυτταρικό μετασχηματισμό.