Potential insect vectors of the phytopathogenic bacterium Xylella fastidiosa in Crete

Abstract

Auchenorrhyncha, including leafhoppers and spittlebugs, are considered serious pests in greenhouse and open field crops worldwide due to their ability of transmitting phytopathogens as well as for the damage they cause by feeding on plant tissues. This study investigates the bioecology of Auchenorrhyncha in the study area of Chania of Western Crete, Greece. Specifically, the population dynamics of Auchenorrhyncha have been recorded in 2-years period from November 2017 to November 2019. Moreover, the life history traits of a leafhopper, namely Euscelis ohausi (Wagner, 1939) (Hemiptera: Cicadellidae), was investigated along with its preferences on several host plants, and the presence of natural enemies. All the above are important components in understanding features of the biology and ecology of this organism and effectively design integrated pest management.Population dynamics and features of the phenology of Auchenorrhyncha including the potential vectors of Xylella fastidiosa Wells and other pathogens were investigated. Additionally, the parasitism of Auchenorrhyncha by Dryinid ectoparasitoids was documented. X. fastiodiosa causes serious diseases in many agricultural crops including the olive and citrus crop, however, to date it is not reported in Greece. Olive groves of Olea europea var. Koroneiki were sampled systematically using two sampling methods, sweeping net and Malaise traps, over a 24-month period. One citrus grove was also sampled for one-year period with a Malaise trap. Samples with the sweeping net were taken from the herbaceous cover, the tree canopy and the field boarders of olive groves. A total of 7,215 specimens of Auchenorrhyncha were collected, belonging to the families of Cicadellidae (78%), Issidae (14%), Aphrophoridae (4%), Delphacidae (3%), and rest of the families (Cicadidae, Cixiidae, Dictyopharidae, Tettigometridae) accounted for less than 1%. Auchenorrhyncha were found to be more abundant on the herbaceous cover of the olive groves compared to the canopy and the field margins. However, on the olive tree canopy, only the species Synophropsis lauri and species of the Issidae family were found in high numbers for most of the sampling period. Aphrophoridae species (Philaenus spumarius and Neophilaenus campestris and N. lineatus) were found mostly on the herbaceous cover and in low numbers at two distinct periods throughout the samplings period one in fall (October, November and December) and one in spring (April and May). Moreover, a richer Aphrophoridae species composition was recorded in an olive compared to a citrus orchard. Furthermore, we found that altitude can influence the population abundance of Auchenorrhyncha in an olive grove environment depending on the insect species.Laboratory experiments were carried out to study attraction and oviposition preference by the leafhopper Euscelis ohausi on Olea europea L. (olive), Avena sativa L. (oat), Vicia sativa L. (vetch), Euryops pectinatus L. (golden euryops) and Lavandula dentata L. (lavender). Oviposition of E. ohausi females was studied in no-choice experiments. The number of eggs laid on oat was 2.3 folds higher compared to vetch, while females did not oviposit on olive, golden euryops and lavender. Host plant attractiveness for E. ohausi individuals was studied in two-choice experiments. The different plant species in pairs with olive branches were introduced in cages and subsequently adult leafhoppers were released in groups. At certain time intervals and for a period up to 24 h the position of insects was recorded. The results showed that, in the case of E. ohausi, adults were more frequently attracted and aggregated on the oat compare to the olive branches. When adults were offered a choice between olive and golden euryops or olive and vetch, no differences were observed in their allocation between the plant species. In contrast, in the two-choice laboratory experiments, adult leafhoppers aggregated more on the olive branches to lavender. These data indicate that among the plant species tested, oat is a preffered and a suitable for ovipostion host of E. ohausi. The effect of temperature on the development and mortality of the leafhopper, E. ohausi was studied in the laboratory. The experiments were conducted in incubators at 15, 20, 25, 30 and 33°C ± 1oC with 65 % RH and 16L:8D h photoperiod on oat (Avena sativa) as host plant. The leafhopper completed development at all temperatures tested. The results show that temperature affected the development, survival and reproduction of E. ohausi. Juvenile survival decreased with increasing temperature and the developmental rate increased linearly over the range 15 to 30°C. A linear and one nonlinear model (Lactin’s) were tested to describe the relationship between temperature and nymphal developmental rate. Lactin’s model fitted the data of egg to adult development well according to the criteria adopted for the model evaluation. The predicted lower developmental threshold temperatures of E. ohausi were 5.2oC (linear model) and 6.5oC (Lactin’s model) and the thermal constant was 777.9 (±60.1) degree-days, whereas the estimated upper threshold temperature (Lactin’s model) was approximately 33.7oC. The estimated values of the intrinsic rate of increase (rm) ranged from 0.0205 at 15oC to 0.0343 at 25oC with the latter been the highest value recorded. Surveys of natural enemies of Auchenorrhyncha and specifically of E. ohausi and E. variegatus were conducted in the study area of Chania, Greece. Natural enemies such as the Hymenoptera egg parasitoids are considered promising biocontrol agents against Auchenorrhyncha, including insect vectors of the bacterium X. fastidiosa. Thus, we studied the seasonal occurrence of the egg parasitoids of the leafhoppers E. ohausi and E. variegatus. Eggs of both species laid under laboratory conditions on oat seedlings, where transferred and exposed to the open field for five days as sentinel egg traps, in order to determine the specific composition and abundance of their parasitoids as well as the rates of parasitism. The overall rate of egg parasitism for both leafhoppers was 8.4 % at the study site of Souda and 15.8 % at Nerokourou. In total two species of egg parasitoids were obtained from the exposed eggs of both hosts, one belonging to the genus Anagrus Haliday (Hymenoptera: Mymaridae) and the other more abundant was identified as Lymaenon litoralis Haliday (Hymenoptera: Mymaridae). Furthermore, the presense of a dipteran (Verrallia sp. (Diptera: Pipunculidae)) parasitoid of nymphs and adults of Cicadellidae species was recorded in the study area as well as of the generalist predator Zelus renardii Kolenati (Hemiptera: Reduviidae).In conclusion, the results of the present study increase our knowledge about the synthesis of the Auchenorrhyncha fauna, potential vectors of X. fastiodiosa, in olive orchards of Crete, their population dynamics and phenology. Furthermore, certain features of the thermal biology and host preference of E. ohausi as well as the presence of natural enemies in the area of study were investigated.

Από τα Αυχενόρρυγχα, τα τζιτζικάκια, είναι σοβαροί εχθροί σε θερμοκήπια και υπαίθριες καλλιέργειες παγκοσμίως λόγω της ικανότητάς τους να μεταδίδουν φυτοπαθογόνα καθώς και για τη ζημιά που προκαλούν διατρεφόμενα από τους φυτικούς ιστούς. Αυτή η μελέτη εστιάζει στην διερεύνηση στοιχείων της βιολογίας και οικολογίας των Αυχενόρρυγχων στην περιοχή μελέτης (Χανιά, Δυτική Κρήτη). Συγκεκριμένα, η δυναμική των πληθυσμών των Αυχενόρρυγχων έχει καταγραφεί για διάστημα δύο ετών, από το Νοέμβριο του 2017 έως το Νοέμβριο του 2019. Επιπλέον, μελετήθηκαν και υπολογίστηκαν δημογραφικές παράμετροι αύξησης των πληθυσμών του Euscelis ohausi Wagner, 1939, καθώς και η προτίμηση και η ωοτοκία του σε διαφορετικά είδη φυτών ξενιστών, ενώ καταγράφηκαν και οι φυσικοί του εχθροί στον αγρό. Τα παραπάνω στοιχεία είναι σημαντικά για την κατανόηση της βιολογίας και οικολογίας των εντόμων αυτών και στη συνέχεια στον σχεδιασμό ολοκληρωμένης διαχείρισης τους στις καλλιέργειες.Στο πλαίσιο της διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε η εποχική εμφάνιση και δυναμική των πληθυσμών των Αυχενόρρυγχων, συμπεριλαμβανομένων των πιθανών φορέων του Xylella fastidiosa και άλλων παθογόνων. Το X. fastiodiosa προκαλεί σοβαρές ασθένειες σε πολλές καλλιέργειες παγκοσμίως, όπως της ελιάς και των εσπεριδοειδών, ωστόσο, μέχρι σήμερα δεν έχει καταγραφεί η παρουσία του στην Ελλάδα. Συστηματικές δειγματοληψίες πραγματοποιήθηκαν σε ελαιώνες (Olea europea, ποικιλία Κορωνέικη) χρησιμοποιώντας δύο μεθόδους δειγματοληψίας, την εντομολογική απόχη και παγίδες Malaise, για περίοδο 24 μηνών. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες σε ένα οπωρώνα εσπεριδοειδών για ένα έτος με τη χρήση παγίδας Malaise. Τα δείγματα με την εντομολογική απόχη συλλέγονταν από την χαμηλή βλάστηση του ελαιώνα, την κόμη των ελαιόδεντρων και τα περιθώρια του αγρού. Συλλέχθηκαν συνολικά 7,215 δείγματα Αυχενόρρυγχων, που ανήκαν στις οικογένειες των Cicadellidae (78%), Issidae (14%), Aphrophoridae (4%), Delphacidae (3%), όπως και στις οικογένειες Cicadidae, Cixiidae, Dictyopharidae, Tettigometridae, οι οποίες αντιπροσώπευαν λιγότερο από 1% του συνόλου. Τα Αυχενόρρυγχα βρέθηκαν να είναι πιο άφθονα στη χαμηλή βλάστηση (ζιζάνια) των ελαιώνων σε σύγκριση με την κόμη των δέντρων και τα περιθώρια του αγρού. Στην κόμη των δέντρων της ελιάς, μόνο το είδος Synophropsis lauri και είδη της οικογένειας Issidae βρέθηκαν σε υψηλούς αριθμούς κατά τη διάρκεια της περιόδου των δειγματοληψιών. Είδη της οικογένειας Aphrophoridae (Philaenus spumarius, Neophilaenus campestris και N. lineatus) βρέθηκαν κυρίως στη χαμηλή βλάστηση και σε μικρούς αριθμούς σε δυο διακριτές περιόδους κατά την περίοδο δειγματοληψίας, μια το φθινόπωρο (Οκτώβριο, Νοέμβριο και Δεκέμβριο) και μια την άνοιξη (Απρίλιο και Μάϊο). Επιπλέον, μεγαλύτερη ποικιλότητα ειδών της οικογένειας Aphrophoridae καταγράφηκε στην καλλιέργεια της ελιάς παρά στα εσπεριδοειδή. Επίσης, παρατηρήθηκε ότι το υψόμετρο επηρεάζουν σημαντικά την σχετική αφθονία των Aυχενόρρυγχων στους ελαιώνες αλλά σε διαφορετικό βαθμό ανάλογα με το είδος.Σε πειράματα εργαστηρίου εξετάστηκε η προτίμηση και η ωοτοκία του E. ohausi στα παρακάτω είδη φυτών ξενιστών: Olea europea L. (ελιά), Avena sativa L. (βρώμη), Vicia sativa L. (βίκος), Euryops pectinatus L. (μαργαρίτα) και Lavandula dentata L. (λεβάντα). Η ωοτοκία των θηλυκών του E. ohausi μελετήθηκε σε πειράματα απλής επιλογής. Ο αριθμός των αυγών που αποτέθηκαν στη βρώμη ήταν 2,3 φορές μεγαλύτερος σε σύγκριση με τον βίκο, ενώ τα θηλυκά δεν απέθεσαν αυγά στην ελιά, τη μαργαρίτα και τη λεβάντα. Η προτίμηση ξενιστή των ατόμων του E. ohausi μελετήθηκε με πειράματα διπλής επιλογής. Τα διαφορετικά είδη φυτών σε συνδυασμό με κλαδιά ελιάς εισήχθησαν σε κλουβιά όπου στη συνέχεια τα ενήλικα άτομα του εντόμου απελευθερώθηκαν σε ομάδες. Σε τακτά χρονικά διαστήματα έως και 24 ώρες μετά την εισαγωγή των εντόμων γίνονταν καταγραφή της θέσης τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, στην περίπτωση του E. ohausi, τα ενήλικα άτομα προσελκύονταν και συγκεντρώνονταν συχνότερα στη βρώμη σε σύγκριση με τα κλαδιά ελιάς. Όταν στα έντομα προσφέρθηκε η επιλογή μεταξύ ελιάς και μαργαρίτας ή ελιάς και βίκου, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στην κατανομή τους μεταξύ των φυτών ξενιστών. Αντίθετα, στα πειράματα επιλογής, τα ενήλικα βρέθηκε να προτιμούν τα κλαδιά της ελιάς σε σχέση με τη λεβάντα. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι μεταξύ των φυτικών ειδών που δοκιμάστηκαν, η βρώμη είναι ένας προτιμώμενος και κατάλληλος για ωοτοκία ξενιστής του E. ohausi. Εξετάστηκε η επίδραση της θερμοκρασίας στην ανάπτυξη, επιβίωση και αναπαραγωγή του E. ohausi. Τα πειράματα διεξήχθησαν σε θαλάμους ελεγχόμενων συνθηκών σε θερμοκρασίες 15, 20, 25, 30 και 33°C ± 1°C, 65±5 % Σ.Υ. και 16Φ:8Σ ώρες φωτοπερίοδο με ξενιστή φυτά βρώμης (Avena sativa). Το έντομο ολοκλήρωσε την ανάπτυξή του σε όλες τις θερμοκρασίες που δοκιμάστηκαν. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θερμοκρασία επηρέασε την ανάπτυξη, την επιβίωση και την αναπαραγωγή του E. ohausi. Η νυμφική επιβίωση μειώθηκε με την αύξηση της θερμοκρασίας και η ταχύτητα ανάπτυξης αυξήθηκε γραμμικά με τη θερμοκρασία στο εύρος από 15 έως 30°C. Χρησιμοποιήθηκε ένα γραμμικό και ένα μη γραμμικό μοντέλο (Lactin) για να περιγράψουν τη σχέση μεταξύ της θερμοκρασίας και της ταχύτητας ανάπτυξης των νυμφών. Το μοντέλο του Lactin παρουσίασε καλή προσαρμογή στα δεδομένα της συνολικής ανήλικης ανάπτυξης. Η θερμοκρασία ουδούς ανάπτυξης του E. ohausi υπολογίσθηκε σε 5,2oC (γραμμικό μοντέλο) και 6,5oC (μοντέλο Lactin) και η θερμική σταθερά σε 777,9 (±60,1) ημεροβαθμούς, ενώ η άνω θερμοκρασία ουδός (μοντέλο Lactin) ήταν περίπου 33,7oC. Οι εκτιμώμενες τιμές της ενδογενούς ταχύτητας αύξησης (rm) κυμάνθηκαν από 0,0205 στους 15oC έως 0,0343 στους 25oC, με την τελευταία να αποτελεί και την υψηλότερη τιμή που καταγράφηκε.Δειγματοληψίες για την ανίχνευση της παρουσίας φυσικών εχθρών των Αυχενόρρυγχων και συγκεκριμένα των E. ohausi και E. variegatus πραγματοποιήθηκαν στην περιοχή μελέτης των Χανίων. Φυσικοί εχθροί όπως τα παρασιτοειδή αυγών (Hymenoptera) θεωρούνται πολλά υποσχόμενοι παράγοντες βιολογικού ελέγχου κατά των Αυχενόρρυγχων, συμπεριλαμβανομένων των εντόμων φορέων του βακτηρίου X. fastidiosa. Μελετήθηκε σε βιολογικούς ελαιώνες η εποχική εμφάνιση ωοπαρασίτων των E. ohausi και E. variegatus. Τα αυγά των δύο ειδών που είχαν αποτεθεί σε εργαστηριακές συνθήκες σε φυτά βρώμης, μεταφέρθηκαν και εκτέθηκαν στο αγρό για διάστημα πέντε ημέρων ως παγίδες παρασιτοειδών, προκειμένου να προσδιοριστεί η σύνθεση των ειδών και η σχετική αφθονία των παρασιτοειδών τους καθώς και τα ποσοστά παρασιτισμού. Το συνολικό ποσοστό παρασιτισμού αυγών και για τα δύο είδη ήταν 8,4 % και 15,8 % στην περιοχή της Σούδας και Νεροκούρου αντίστοιχα. Συνολικά εντοπίσθηκαν δύο είδη ωοπαρασίτων, το ένα ανήκει στο γένος Anagrus Haliday (Hymenoptera: Mymaridae) και το άλλο με μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης ταυτοποιήθηκε ως Lymaenon litoralis Haliday (Hymenoptera: Mymaridae).Επιπλέον, η παρουσία ενός διπτέρου παρασιτοειδούς (Verrallia sp. (Diptera: Pipunculidae)) των νυμφών και των ενηλίκων των ειδών της οικογένειας Cicadellidae καταγράφηκε στην περιοχή μελέτης, όπως και το αρπακτικό Zelus zenardii Kolenati (Hemiptera: Reduviidae).Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης αυξάνουν τις γνώσεις μας για τη σύνθεση της πανίδας των Αυχενόρρυγχων, δυνητικών φορέων του X. fastidiosa, σε ελαιώνες της Κρήτης, τη πληθυσμιακή τους δυναμική και τη φαινολογία τους. Επιπλέον, μελετήθηκαν ορισμένα στοιχεία της βιολογίας και της συμπεριφοράς επιλογής ξενιστή του E. ohausi καθώς και η παρουσία των φυσικών του εχθρών στην περιοχή μελέτης.