Μελέτη της αύξησης της κάτω γνάθου σε επίμυες, που εργαστηριακά έχουν τροποποιηθεί και γεννηθεί με ενδομήτριο περιορισμό της αύξησης

Abstract

INTRODUCTION: We have intrauterine growth retardation (IUGR) when there is an inability of the newborn to reach the predetermined (expected) growth potential. IUGR is a manifestation of different pathological conditions of the fetal unit and is associated with increased morbidity and mortality in intrauterine and extrauterine life. It occurs in 3-10% of pregnancies. Perinatal morbidity and mortality rates increase dramatically with decreasing birth weight. The causes of IUGR can be from the mother, the placenta, or the fetus. These children are smaller in size than their normal counterparts. The presence of microcephaly at birth and the limited increase in head size are the most important factors of adverse neurodevelopmental outcome.AIM: The aim of this study was to compare the qualitative and quantitative characteristics of the mandible in rats that have undergone IUGR with control groups of normal rats. In the present study, the morphological, mechanical, and physicochemical properties of the mandibular bones and condyle of rats born with IUGR will be investigated.MATERIALS AND METHODS: Six first-time pregnant Wistar rats at day 11 of gestation (“mothers”) were purchased from the Hellenic Pasteur Institute, and the experiment was conducted at the Laboratory for Research of the Musculoskeletal System “Theodoros Garofalidis”. The mothers were housed individually in cages and had free access to water. The mothers were kept free of pathogens and treated in compliance with standardized institutional guidelines. All mothers were fed a standard laboratory rat food. For the experiment a model of rats that were either fed ad libitum or underwent 50% food restriction during pregnancy was used. Three randomly selected mothers underwent 50% food restriction diet from day 12 of gestation until the end of pregnancy, at day 21. At birth, the offspring were culled to 8 (4 males and 4 females) per litter to normalize rearing. Two offspring groups were assembled: Group A-IUGR, composed of 12 male rats born from mothers that underwent 50% food restriction, and Group B-control, composed of 12 male rats born from mothers that were fed ad libitum. Both offspring groups and all mothers after gestation were fed ad libitum. During the post lactation period from day 21 a standard diet was available ad libitum to all offspring. The experiment ended when the offspring reached day 150. The rats were weighed on a digital precision scale immediately after birth, and at 30, 60 and 150 days. The tibia and the proximal tibial metaphysis were examined at days 60 and 150, and the mandible at day 150, after the sacrifice of the offspring. Lateral and anterior-posterior cephalometric radiographs were also taken in each animal. When the rats were 150 days (5 months old) the experiment was completed. In each of the male rats, 2 bone mineral density (BMD) measurements were performed with DEXA at 60 and 150 days, respectively, and 2 radiographs of a lateral cephalometric and a posterior cephalometric were taken and analyzed. After sacrifice, for the mandible, DEXA was performed at Area 1, 2 mm above the antegonial notch and Area 2, 2 mm above menton (Me), the most inferior point of the mandibular symphysis. The levels of osteocalcin, 25-OH vitamin D and phosphorus in blood plasma were examined. The right hemispheres of the rats' heads were used for histological and histomorphometric analysis. In the digitized incisions, the % of bone area and marrow spaces was determined for the mandibular bone. The ROI of the mandibular bone (mROI) extended from the distal of the periodontal membrane of the incisor tooth to the most mesial point of the mesial root of the first molar tooth. For the condylar bone (cROI) was defined by a square positioned beneath the interface of the cartilage and the subchondral bone and located at the center of the posterior third of the condylar cartilage. The condylar cartilage (lROI) included the fibrous, proliferative, mature, and hypertrophic layer of the condyle, with the mature and hypertrophic layers examined. The thickness for each layer was expressed as a percentage. Finally, the average thickness for each layer was calculated.RESULTS: It was observed that even though the offspring number did not differ between the two groups the birth weight was lower for IUGR, compared to control offspring with the difference being statistically significant (p<0.005). Weight measurements which were taken at day 30, 60 and 150 also showed statistically significant differences. The IUGR group presented lower values of total tibia and proximal tibial metaphysis at days 60 (p<0.005) and 150 (p<0.005), and regardless of time (p<0.005). BMD of mandibular Area 1 at day 150 for IUGR was statistically significantly lower than the control (p<0.0005). Same for Area 2, significant difference was (p=0.003). The IUGR group showed lower values for all lateral cephalometric measurements (p <0.05) at both 2 and 5 months, with the only exception being the Coronoid-Menton measurement at 2 months, compared to controls. The highest difference between the groups was shown by the Po-Na measurement at 2 and 5 months (p <0.0005). Pa-T and Po-Na measurements at 2 months and Po-Na and Go’-menton measurements at 5 months are the most statistically significant factors that detect abnormal growth based on lateral cephalometric measurements. From the analysis on the anterior-posterior radiographs, the IUGRs showed statistically significantly lower values compared to the controls for cranial length measurements (P-A) at 2 months p <0.005 and 5 months p <0.005. Only the measurement for cranial length at 2 and 5 months is the most statistically important factor that detects abnormal growth based on the anterior-posterior cephalometric measurements. The IUGR group compared to the control group presented at day 150 statistically significantly lower values for osteocalcin (p=0.021) and phosphorus (p=0.028), but not for 25-OH vitamin D (p=0.352). Histomorphometric analysis of the samples revealed that the IUGR showed statistically significant differences compared to the controls. Specifically, in the IUGR group, there was a decrease in the values compared to the control group for the % percentages of bone mROI (p = 0.007) and cROI (p <0.005), and an increase in the values of % marrow space mROI and cROI. In the IUGR group there was a decrease in the values for the fibrous layer index (p = 0.036) and an increase in the values for the hypertrophic layer index (p = 0.053) compared to the controls. No statistically significant difference was observed for the proliferative layer (p = 0.802).CONCLUSION: IUGR significantly affects bone density of long bones in the proximal metaphysis of the tibia and in the total tibia, which does not finally recover even after five months of living in rats with a normal diet. They showed reduced bone density in the mandibular bone at both 2 and 5 months compared to their normal counterparts. Biochemical indicators of bone metabolism: osteocalcin, vitamin D and phosphorus were lower for rats with IUGR. All measurements of lateral cephalometric radiographs for the mandible show significant differences. The mandibular bones of IUGR rats are smaller in both the ramous at 2 and 5 months and the body compared to normal rats. Po-Na measurements reflect the increase in craniofacial development show the biggest difference with the IUGR being smaller than normal in both 2 and 5 months of the experiment. IUGR does not affect the development of the neurocranium, measurements in the anterior-posterior radiographs, did not differ in IUGR and control. Bone area percentage in the mandible was significantly lower in IUGR compared to controls the same for the subchondral bone of the condyle. IUGR had a significantly reduced articular (fibrous) layer compared to normal rats. The thickness of the proliferating layer of IUGR did not differ. Finally, the mature chondrocyte layer and the hypertrophic layer evaluated together (hypertrophic) were increased compared to control.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Ενδομήτρια υπολειπόμενη ανάπτυξη (ΕΥΑ) έχουμε όταν παρατηρείται αδυναμία του νεογνού να φτάσει το προκαθορισμένο (αναμενόμενο) δυναμικό αύξησης. H EYA αποτελεί εκδήλωση διαφορετικών παθολογικών καταστάσεων της εμβρυομητρικής μονάδας και σχετίζεται με αυξημένη νοσηρότητα και θνησιμότητα στην ενδομήτρια και εξωμήτρια ζωή. Εμφανίζεται στο 3-10% των κυήσεων. Οι δείκτες περιγεννητικής νοσηρότητας και θνησιμότητας αυξάνουν δραματικά με την μείωση του βάρους γέννησης. Τα αίτια που προκαλούν ΕΥΑ μπορεί να προέρχονται από τη μητέρα, από τον πλακούντα ή από το έμβρυο. Αυτά τα παιδιά είναι μικρότερα σε μέγεθος από τα αντίστοιχα φυσιολογικά. Η παρουσία μικροκεφαλίας στη γέννηση και η περιορισμένη αύξηση του μεγέθους της κεφαλής αποτελούν τους πιο σημαντικούς παράγοντες δυσμενούς νευροαναπτυξιακής έκβασης. ΣΚΟΠΟΣ: Η εργασία αποσκοπεί στη σύγκριση των ποιοτικών και ποσοτικών χαρακτηριστικών της κάτω γνάθου επίμυων που έχουν υποστεί ΕΥΑ με ομάδες ελέγχου φυσιολογικών επίμυων. Στην παρούσα μελέτη θα διερευνηθούν οι μορφολογικές, μηχανικές και φυσικοχημικές ιδιότητες, στα οστά της κάτω γνάθου και του κονδύλου επίμυων που έχουν γεννηθεί με ενδομήτρια υπολειπόμενη αύξηση. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ: Υλικό για τη μελέτη αποτέλεσαν 6 πρωτότοκοι θηλυκοί κυοφορούντες επίμυες φυλής Wistar. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε στο Εργαστηρίου Έρευνας Παθήσεων Μυοσκελετικού Συστήματος «Θ. Γαροφαλίδης» H πειραματική διατροφική παρέμβαση στους επίμυες, ξεκίνησε την 12η μέρα της κύησης. Την ημέρα αυτή οι επίμυες διαχωρίστηκαν με τυχαίο τρόπο σε δυο διατροφικές ομάδες αποτελούμενες από 3 επίμυες η καθεμία. α) Η ομάδα μειωμένης πρόσληψης τροφής κατά 50% (ΕΥΑ group). β) η ομάδα ελέγχου (control group) που κατανάλωναν τροφή ελεύθερα χωρίς περιορισμό (ad libitum) καθόλη τη διάρκεια της εγκυμοσύνης. Οι αρσενικοί απόγονοι επίμυες αποτελούν και το τελικό δείγμα του πειράματος. Το τελικό δείγμα αποτελείτο από 12 αρσενικούς επίμυες IUGR και από 12 αρσενικούς επίμυες που ανήκαν στην ομάδα ελέγχου (control). Οι άρρενες απόγονοι και των δύο ομάδων συνέχισαν να εκτρέφονται σύμφωνα με το πρωτόκολλο του πειράματος μέχρι που έγιναν 150 ημερών (5 μηνών) οπότε και θανατώθηκαν για να συνεχιστεί η επόμενη φάση του πειράματος. Όταν οι επίμυες έγιναν 60 ημερών (2 μηνών) εκτιμήθηκε η οστική πυκνότητα κάθε ζώου. Επίσης σε κάθε ζώο ελήφθησαν κεφαλομετρικές και οπισθοπρόσθιες ακτινογραφίες. Όταν οι επίμυες έγιναν 150 ημερών (5 μηνών) το πείραμα ολοκληρώθηκε. Σε κάθε έναν από τους άρρενες επίμυες έγιναν 2 μετρήσεις οστικής πυκνότητας (BMD) με DEXA στις 60 και 150 ημερών αντίστοιχα και 2 λήψεις ακτινογραφιών μιας πλάγιας κεφαλομετρικής και μιας οπισθοπρόσθιας κεφαλομετρικής οι οποίες και αναλύθηκαν. Κατόπιν της ευθανασίας μελετήθηκε η οστική πυκνότητα στην κάτω γνάθο σε δυο περιοχές (Area 1) που βρίσκεται 2 χιλ πάνω από την μεγαλύτερη καμπυλότητα της κάτω γνάθου και (Area 2) που βρίσκεται στα 2 χιλ πάνω από το σημείο Me (menton). Και εξετάστηκαν τα επίπεδα της οστεοκαλσίνης, της 25-OH βιταμίνης D και του φωσφόρου στο πλάσμα του αίματος. Για την ιστολογική και ιστομορφομετρική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν τα δεξιά ημιμόρια της κεφαλής των επίμυων. Στις ψηφιοποιημένες τομές, για το οστό της κάτω γνάθου προσδιορίστηκε το % ποσοστό του οστού και των μυελικών χώρων. Το συνολικό εμβαδόν υπολογίστηκε στην περιοχή που ορίζεται από (α) την μεσότητα και προς τα άπω της περιοδοντικής μεμβράνης του κεντρικού τομέα, (β) του πλέον εγγύς σημείου της εγγύς ρίζας του 1ου γομφίου και (γ) τα πλευρικά όρια του οστού. Η περιοχή αυτή ονομάστηκε mROI. Στους κονδύλους υπολογίστηκε με την βοήθεια σταθερού τετραγώνου στο μέσω του οπίσθιου τριτημορίου του κονδύλου στο υποχονδριακό οστό το % ποσοστό των οστικών δοκίδων και των μυελικών χώρων το cROI. Τέλος προσδιορίστηκε το πάχος των στιβάδων. Διακρίθηκαν η ινώδης και η βλαστική (πολλαπλασιαζόμενη) στιβάδα, ενώ η στιβάδα των ώριμων χονδροκυττάρων και η υπερτροφική χονδρική στιβάδα αξιολογήθηκαν μαζί. Στους κονδύλους η ROI για τις στιβάδες αποτελεί το σύνολο του πάχους των στιβάδων και βάση αυτού έγινε η αξιολόγησή τους και ονομάστηκε lROI.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Παρατηρήθηκε ότι παρόλο που ο αριθμός των απογόνων δεν διέφερε μεταξύ των δύο ομάδων, το βάρος γέννησης ήταν χαμηλότερο για τα IUGR, σε σύγκριση με τους απογόνους ελέγχου με τη διαφορά να είναι στατιστικά σημαντική (p<0,005). Οι μετρήσεις βάρους που ελήφθησαν τον 1ο, 2ο και 5ο μήνα έδειξαν επίσης στατιστικά σημαντικές διαφορές. Η ομάδα IUGR παρουσίασε χαμηλότερες τιμές οστικής πυκνότητας της ολικής κνήμης από την ομάδα ελέγχου στους 2 (p<0,005) και 5 μήνες (p<0,005) και ανεξάρτητα από το χρόνο (p<0,005). Όμοια παρατηρήθηκε και για την εγγύς μετάφυση της κνήμης. Η οστική πυκνότητα της κάτω γνάθου (Area 1) ήταν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερη (p<0,0005) για τα IUGR σε σύγκριση με τα control. Όμοια και στην (Area2) αποκαλύπτοντας στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0,003). Η ομάδα των IUGR εμφάνιζε χαμηλότερες τιμές για όλες τις πλάγιες κεφαλομετρικές μετρήσεις (p<0,05) τόσο στους 2 όσο και στους 5 μήνες, εξαίρεση αποτέλεσε μόνο η μέτρηση Coronoid -Menton στους 2 μήνες, σε σύγκριση με τα control. Την υψηλότερη διαφορά μεταξύ των ομάδων την παρουσίασε η μέτρηση Po-Na στους 2 και στους 5 μήνες (p <0,0005). Οι μετρήσεις Pa-T και Po-Na στους 2 μήνες και οι μετρήσεις Po-Na και Go’-menton στους 5 μήνες είναι οι πιο στατιστικά σημαντικοί παράγοντες που ανιχνεύουν ανώμαλη αύξηση βασιζόμενοι στις πλάγιες κεφαλομετρικές μετρήσεις. Από την ανάλυση στις οπισθοπρόσθιες ακτινογραφίες τα IUGR εμφάνισαν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερες τιμές σε σύγκριση με τα control για τις μετρήσεις cranial length (P-A) στους 2 μήνες p<0,005 και 5 μήνες p<0,005. Μόνο η μέτρηση για το cranial length στους 2 και στους 5 μήνες αποτελεί τον πιο στατιστικά σημαντικό παράγοντα που ανιχνεύει την ανώμαλη αύξηση στηριζόμενοι στις οπισθοπρόσθιες κεφαλομετρικές μετρήσεις. Η ομάδα IUGR σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου παρουσίασε στατιστικά σημαντικά χαμηλότερες τιμές για την οστεοκαλσίνη (p=0,021) και τον φώσφορο (p=0,028), αλλά όχι για 25-OH βιταμίνη D (p=0,352). Η ιστομορφομετρική ανάλυση των δειγμάτων αποκάλυψε ότι η ομάδα IUGR παρουσίασε στατιστικά σημαντικές διαφορές σε σχέση με τα control. Συγκεκριμένα στην ομάδα IUGR, παρατηρήθηκε μείωση των τιμών σε σχέση με την ομάδα ελέγχου για τα % ποσοστά οστού mROI (p=0,007) και cROI (p<0,005), και αύξηση των τιμών % μυελικών χώρων mROI και cROI. Συγκεκριμένα στην ομάδα IUGR παρατηρήθηκε μείωση των τιμών για τον δείκτη της ινώδους στιβάδας (p=0,036) και αύξηση των τιμών για το δείκτη της υπερτροφικής στιβάδας (p=0,053) σε σχέση με τα control. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά για τον δείκτη της πολλαπλασιαζόμενη στιβάδας (p=0,802).ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Η ενδομήτρια υπολειπόμενη ανάπτυξη επηρεάζει σημαντικά την οστική πυκνότητα των μακρών οστών στην εγγύς μετάφυση της κνήμης και στην ολική κνήμη η οποία δεν αποκαθίσταται τελικά ούτε μετά από πέντε μήνες δια-βίωσης των επίμυων με φυσιολογική διατροφή. Παρουσίαζαν τόσο στους 2 όσο και στους 5 μήνες μειωμένη οστική πυκνότητα στο οστό της κάτω γνάθου σε σύγκριση με τους αντίστοιχους φυσιολογικούς. Οι τιμές των βιοχημικών δεικτών του οστικού μεταβολισμού: οστεοκαλσίνη, βιταμίνη D και φώσφορος ήταν χαμηλότερες για τους επίμυες με ΕΥΑ.Σημαντικές διαφορές παρουσιάζουν όλες οι μετρήσεις των πλαγίων κεφαλομετρικών ακτινογραφημάτων για την αύξηση και την ανάπτυξη της κάτω γνάθου. Η κάτω γνάθος των επίμυων με ΕΥΑ είναι μικρότερη τόσο στον κλάδο (ύψος) στους 2 και 5 μήνες όσο και στο σώμα (μήκος) σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς επίμυες. Οι μετρήσεις Po-Na που αντικατοπτρίζουν την αύξηση του προσωπικού κρανίου παρουσιάζουν την μεγαλύτερη διαφορά με τους ελλειποβαρείς επίμυες να είναι μικρότεροι από τους φυσιολογικούς τόσο στους 2 όσο και στους 5 μήνες του πειράματος. Η ΕΥΑ δεν επηρεάζει την ανάπτυξη του εγκεφαλικού κρανίου. Οι μετρήσεις που αφορούσαν το εγκεφαλικό κρανίο, στις οπισθοπρόσθιες ακτινογραφίες, δεν διέφεραν στους ελλειποβαρείς επίμυες και στους φυσιολογικούς. Για το οστό της κάτω γνάθου των ελλειποβαρών επίμυων το % εκατοστιαίο ποσοστό των οστικών δοκίδων ήταν μικρότερο. Όμοια για το υποχονδριακό οστό του κονδύλου της κάτω γνάθου παρουσίαζε μικρότερο % εκατοστιαίο ποσοστό οστικών δοκίδων σε σύγκριση με των φυσιολογικών. Οι επίμυες που είχαν υποστεί ενδομήτρια υπολειπόμενη ανάπτυξη παρουσίαζαν σημαντικά μειωμένη την αρθρική (ινώδη) στιβάδα σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς επίμυες. Το πάχος της πολλαπλασιαζόμενης στιβάδας των ελλειποβαρών επίμυων δεν παρουσίαζε διαφορές. Τέλος η στιβάδα των ώριμων χονδροκυττάρων και η υπερτροφική στιβάδα που αξιολογήθηκαν μαζί (υπερτροφική) ήταν αυξημένη.