Histological, radiographic and biochemical changes of the temporomandibular joint in rats following mandibular compressive loading

Abstract

Objective:To investigate changes (radiographic, biochemical, histological) of the condyle and the mandible in rats that have undergone restriction in the mandibular growth through mechanical loading with an orthodontic / orthopedic device compared to rats without using the device.Materials and Methods: Seventy-two Wistar rats were used in this study. They were divided into two equal groups of thirty-six rats each. Each group consisted of 3 subgroups. For each experimental subgroup there was a corresponding control subgroup, with no devices. The first day of the experiment was the 30th day of life of the experimental animals and the total duration of the experiment was 90 days. The animals were sacrificed after 30 (subgroups A1, B1), 60 (subgroups A2, B2) and 90 (subgroups A3, B3) days from the start of the experiment. On the 60th day of the experiment the orthodontic devices were removed from the remaining animals. During the whole experimental period, rats were fed mashed food. Cone beam computed tomographies were used for three-dimensional analysis. Blood samples were collected from the eye. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits were used to determine OPG, RANKL and MCSF levels in the blood serum. After sacrifice, the mandibular condyles were isolated and examined histologically.Results: From the three-dimensional radiographic analysis, measurements revealed significant differences in the anteroposterior dimensions between experimental and control subgroups. However, the observed changes in the vertical dimensions, Condylion/Go’ - Menton and the Intercondylar distance proved insignificant. No statistically significant changes by group or timing were found in the levels of OPG, RANKL and MCSF. Histological analysis revealed significant histomorphometric differences in the mandibular condyle. In particular, the Bone Surface / Total Surface ratio was found diminished in both the anterior and posterior condylar regions. Lastly, a significant reduction was found in the Posterior Condylar Cartilage Thickness.Conclusions: 1.Posterior mandibular displacement of the mandible in growing rats affects the morphology of the mandible and culminates in the development of a smaller mandible at a grown age. 2.The orthodontic / orthopedic intervention was not shown to affecting the levels of the studied proteins in the systemic circulation. 3.Posterior mandibular displacement can cause histological region-specific changes in the microarchitecture of the condylar bone and cartilage thickness.The present study emphasized the long-term stability of the outcomes, revealing that the mandible does not show catch-up growth following treatment.

Εισαγωγή - Επιστημονικό Υπόβαθρο: Οι μηχανικές φορτίσεις διαδραματίζουν θεμελιώδη ρόλο στις κυτταρικές διεργασίες κατά τη διάρκεια της μορφογένεσης των ιστών. Κατά την άσκηση της ορθοδοντικής και οδοντοπροσωπικής ορθοπεδικής εφαρμόζονται διάφορα θεραπευτικά σχήματα που ως στόχο έχουν τη συγκράτηση της αύξησης της κάτω γνάθου. Παρά το γεγονός, ότι οι προαναφερόμενες θεραπευτικές μέθοδοι χρησιμοποιούνται τουλάχιστον από τις αρχές του εικοστού αιώνα, δεν είναι ακόμη τεκμηριωμένες οι επιδράσεις τους στις κυτταρικές δομές της γναθοπροσωπικής περιοχής.Κόνδυλος κάτω γνάθουΠολλές μελέτες έχουν εξετάσει την αύξηση της κάτω γνάθου, και ειδικά τους κονδύλους της κάτω γνάθου. Η αύξηση του κονδύλου επηρεάζεται από κληρονομικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες, από ορμόνες και το μεταβολισμό, και είναι σημαντική για την αύξηση του κρανιοπροσωπικού συμπλέγματος. Η οδοντική σύγκλειση επηρεάζει την αύξηση των κονδύλων, καθώς οι κόνδυλοι δέχονται πιέσεις από μασητικές δυνάμεις που εφαρμόζονται στα δόντια. Συγκεκριμένα, οι συγκλεισιακές ανωμαλίες επηρεάζουν το μέγεθος του κονδύλου, το πάχος του χόνδρου και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Επίσης, επηρεάζουν τη θέση του κονδύλου, που φυσιολογικά θα πρέπει να βρίσκεται στο κέντρο της κροταφικής γλήνης, με αποτέλεσμα τη μη ομαλή μεταφορά των δυνάμεων στην Κροταφογναθική Διάρθρωση και τη δημιουργία δυσλειτουργιών. Ορισμένοι ερευνητές αναφέρονται στη συσχέτιση μεταξύ δυσλειτουργίας Κροταφογναθικής Διάρθρωσης και μεταβολής της θέσης του κονδύλου, ως αποτέλεσμα κακής σύγκλεισης.Προηγούμενες μελέτες έχουν εξετάσει το χόνδρο του κονδύλου κάτω από διάφορες συνθήκες σε πειραματόζωα. Σε προηγούμενες μελέτες, η οπίσθια μετατόπιση του κονδύλου μείωσε τον αριθμό των αρχέγονων κυττάρων και εμπόδισε τον πολλαπλασιασμό των χονδροκυττάρων και μείωσε την ποσότητα της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Διακοπτόμενη οπίσθια μετατόπιση του κονδύλου, λόγω ανωμαλίας σύγκλεισης, επιφέρει ακανόνιστη αναδιαμόρφωση του χόνδρου του κονδύλου και τραυματισμό των νεύρων. Ακανόνιστη φόρτιση της Κροταφογναθικής Διάρθρωσης μπορεί να είναι επιβλαβής για το χόνδρο του κονδύλου και για το σπογγώδες οστούν.Ωστόσο, δεν υπάρχουν αρκετές μελέτες που να εξετάζουν τις αλλαγές στο οστούν μακροπρόθεσμα.Σκοπός της μελέτης:Σκοπός της παρούσας έρευνας είναι η διερεύνηση σε ιστολογικό, απεικονιστικό και βιοχημικό επίπεδο των διεργασιών που συμβαίνουν στην Κροταφογναθική Διάρθρωση και συγκεκριμένα στον κόνδυλο και η μελέτη της αύξησης της κάτω γνάθου, κατά τη συγκράτηση της αύξησης της κάτω γνάθου, μέσω της άσκησης μηχανικής φόρτισης με ορθοδοντικούς/ορθοπεδικούς μηχανισμούς σε επίμυες. Στόχοι της μελέτης Η διερεύνηση των αλλαγών που συμβαίνουν στον κόνδυλο της κάτω γνάθου, ύστερα από οπίσθια μετατόπισή του και η μελέτη της αύξησης της κάτω γνάθου. Συγκεκριμένα θα διερευνηθούν:α) Σε ιστολογικό επίπεδο, μέσω παρατήρησης σε οπτικό μικροσκόπιο οι ιστομορφολογικοί χαρακτήρες των εξεταζόμενων περιοχών, καθώς και η οστεοκλαστική δραστηριότητα, β)Σε απεικονιστικό επίπεδο, η μελέτη της μορφολογίας και της δομής της κάτω γνάθου, σε τρισδιάστατο επίπεδο, μέσω μετρήσεων που θα προκύψουν από αξονική τομογραφία κωνικής δέσμης, γ) Σε βιοχημικό επίπεδο, οι μεταβολές στο σύστημα Οστεοπροτεγερίνης (OPG) - Συνδέτη του ενεργοποιητή του υποδοχέα του πυρηνικού παράγοντα ΚΒ (RANKL) και στον Παράγοντα διέγερσης αποικιών μακροφάγων (MCSF).Υλικά και Μέθοδος: Το πειραματικό πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Διεύθυνση Κτηνιατρικής της Περιφέρειας Αττικής και έλαβε αριθμό πρωτοκόλλου 598742/04-10-2019, με κωδικό καταχώρησης EL 25 BIO 05, σύμφωνα με την Ελληνική Εθνική νομοθεσία (ΠΔ 56/2013), την Ευρωπαϊκή Οδηγία 2010/63/ΕΕ και αυτή του Ευρωπαϊκού Συμβουλίου (276/33/20.10.2010) σχετικά με την προστασία των σπονδυλωτών ζώων που χρησιμοποιούνται σε πειράματα και για άλλους επιστημονικούς σκοπούς. Σχεδιασμός Πειράματος: Στην παρούσα πειραματική μελέτη χρησιμοποιήθηκαν εβδομήντα δύο (72) αρσενικοί επίμυες Wistar ηλικίας τεσσάρων εβδομάδων. Μετά την αρχική τους ανατροφή τεσσάρων εβδομάδων στο Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ, όλα τα ζώα μεταφέρθηκαν και στεγάστηκαν στο Εργαστήριο Πειραματικής Χειρουργικής και Χειρουργικής Έρευνας «Ν. Σ. Χρηστέας» στην Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου Αθηνών. Η τυποποίηση σύμφωνα με την εθνική και ευρωπαϊκή νομοθεσία, καθόρισε επιλογή κλωβού (Tecniplast SPA, Ιταλία) και σταθερό κεντρικό αερισμό (15 αλλαγές αέρα/ώρα), περιβαλλοντικές συνθήκες σε 55% σχετική υγρασία, θερμοκρασία 20°C ± 2°C και τεχνητό 12ωρο εύρος εναλλασσόμενων κύκλων φωτός-σκότους. Η πρόσβαση σε τροφή και νερό ήταν κατά βούληση.Τα πειραματόζωα κατανεμήθηκαν τυχαία σε ίσες ομάδες, συγκεκριμένα τις ομάδες Α (πειραματική) και Β (ελέγχου), η καθεμία χωρίστηκε σε τρεις ίσου μεγέθους υποομάδες με δώδεκα επίμυες (Α1, Α2, Α3, Β1, Β2, Β3). Για την ομαδοποίηση χρησιμοποιήθηκε το διαδικτυακό εργαλείο Random Team Generator.Τροποποιημένες ορθοδοντικές ενδοστοματικές συσκευές, που έχουν περιγραφεί σε προηγούμενες μελέτες, τοποθετήθηκαν στα πειραματόζωα και οδηγούσαν σε οπίσθια μετατόπιση της κάτω γνάθου. Οι πλήρως χυτές μεταλλικές ορθοδοντικές συσκευές κατασκευάστηκαν στο εργαστήριο, μετά από ψηφιακή ενδοστοματική σάρωση (TRIOS 3, 3Shape intraoral scanner) ενός ζώου που επιλέχτηκε τυχαία.Οι τροποποιημένες συσκευές συγκολλήθηκαν στους τομείς της άνω γνάθου με οξυφωσφορική κονία (Harvard Cement Normal Setting; Harvard Dental International GmbH, 15366 Hoppegarten, Γερμανία). Κατά τη διάρκεια ολόκληρης της πειραματικής περιόδου, όλα τα πειραματόζωα (πειραματικά και ελέγχου) τρέφονταν με μαλακή τροφή, η οποία παρήχθη με ανάμειξη σφαιριδίων με νερό σε τυποποιημένες αναλογίες για να επιτευχθεί μαλακή σύσταση.Συνολικά, η πειραματική περίοδος διήρκεσε 90 ημέρες. Τα πειραματόζωα θυσιάστηκαν στις 30 ημέρες (υποομάδες Α1, Β1), 60 ημέρες (υποομάδες Α2, Β2) και 90 ημέρες (υποομάδες Α3, Β3). Την 60ή ημέρα του πειράματος, οι ορθοδοντικές συσκευές αφαιρέθηκαν από την πειραματική υποομάδα Α3. Καθ' όλη τη διάρκεια της πειραματικής περιόδου, όλα τα πειραματόζωα παρακολουθούνταν στενά για φυσιολογική ανάπτυξη. Τρισδιάστατη ακτινογραφική ανάλυση: Για τη μελέτη σε τρισδιάστατο επίπεδο της μορφολογίας της κάτω γνάθου, πραγματοποιήθηκαν αρχικές (ημέρα 1η του πειράματος) και τελικές (ημέρα θυσίας) υπολογιστικές τομογραφίες κωνικής δέσμης (CBCT) σε κάθε πειραματόζωο. Στους επίμυες έγινε αναισθησία με ενδομυϊκή ένεση με συνδυασμό κεταμίνης-ξυλαζίνης σε δοσολογία 0,2 ml/kg. Όλοι οι επίμυες σαρώθηκαν με την ίδια μονάδα CBCT (New Tom VGi, Cefla SC, Imola, Ιταλία) χρησιμοποιώντας το ίδιο οπτικό πεδίο (8Χ8 cm, υψηλής ανάλυσης, σάρωση οδοντοστοιχίας) με ρυθμίσεις έκθεσης 110 kV. Κάθε σάρωση διεξήχθη από Γναθοπροσωπικό Ακτινολόγο. Στις περιπτώσεις που κρίθηκε απαραίτητο, οι σαρώσεις επαναλήφθηκαν. Διενεργήθηκε τρισδιάστατη ανάλυση με γραμμικές μετρήσεις με χρήση του λογισμικού Viewbox (Viewbox© έκδοση 4.1.0.10, dHAL Software, Κηφισιά, Ελλάδα). Βιοχημική ανάλυση:Για τη μέτρηση των επιπέδων των πρωτεϊνών OPG (Οστεοπρωτεγερίνη), RANKL (Συνδέτη του ενεργοποιητή του υποδοχέα του πυρηνικού παράγοντα ΚΒ) και MCSF (Παράγοντα διέγερσης αποικιών μακροφάγων), συλλέχθηκε ορός αίματος από τους επίμυες. Πιο συγκεκριμένα, έγινε αρχική (ημέρα 1η του πειράματος) και τελική (ημέρα θυσίας), αιμοληψία. Τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν παροδικά σε θάλαμο αιθέρα. Στη συνέχεια, συλλέχθηκαν δείγματα αίματος, με τη χρήση λεπτής αποστειρωμένης εργαστηριακής πιπέτας, η οποία εισήχθη στην περιοχή των ματιών, πίσω από το βολβό του ματιού. Το αίμα τοποθετήθηκε σε δοκιμαστικούς σωλήνες που περιείχαν ηπαρίνη και φυγοκεντρήθηκε στις 13.000 rpm για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια συλλέχθηκε ο ορός και αποθηκεύτηκε στους -20oC για περαιτέρω ανάλυση.Τα επίπεδα πρωτεϊνών μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ELISA κιτ (Elabscience®, ΗΠΑ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν σε φασματοφωτόμετρο ELISA (Thermo Scientific Multiskan GO Microplate Spectrophotometer). Ιστολογική προετοιμασία:Πριν την ανάκτηση των αισθήσεών τους, τα πειραματόζωα θυσιάστηκαν. Τα παρασκευάσματα διατηρήθηκαν σε διάλυμα φορμαλίνης 10%. Στη συνέχεια, ο αριστερός κόνδυλος από κάθε κάτω γνάθο απομονώθηκε και επεξεργάστηκε περαιτέρω ιστολογικά. Οι τομές χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ) για να παρατηρηθούν πιθανές ιστομορφολογικές αλλαγές, τόσο στο οστό του κονδύλου της κάτω γνάθου, όσο και στη χόνδρινη επιφάνειά του. Στατιστική επεξεργασία: Ο αριθμός των πειραματόζωων, έπρεπε να είναι μεν μικρός για ηθικούς λόγου, ικανός όμως ώστε να εντοπιστούν αξιόπιστα στατιστικά αποτελέσματα. Ο υπολογισμός του δείγματος έγινε χρησιμοποιώντας ανάλυση ισχύος.Ο αριθμός των 12 επίμυων ανά υποομάδα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τυπικά στατιστικά κριτήρια (a = 0,05, b = 0,10), αποδίδοντας ισχύ 90% για την ανίχνευση διαφοράς 0,5 mm (26,5 έναντι 27,0 SD 0,37) για το πρωταρχικό αποτέλεσμα της μελέτης, δηλαδή το μήκος της κάτω γνάθο (Condylion - I’). Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 72 επίμυες, κατανεμημένοι ισόρροπα σε πειραματική και ομάδα ελέγχου.Διενεργήθηκαν γραμμικά μοντέλα παλινδρόμησης, ANOVA ή Kruskal-Wallis στατιστικές δοκιμασίες. Ορίστηκε α = 5% επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας (p – value < 0.05). Τα δεδομένα επεξεργάστηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό στατιστικής Stata ver.14 (Stata Statistical Software: Release 14. College Station, TX: StataCorp LP.)Αποτελέσματα:Από την τρισδιάστατη ακτινογραφική ανάλυση, οι μετρήσεις αποκάλυψαν σημαντικές διαφορές στις προσθιοπίσθιες διαστάσεις μεταξύ των πειραματικών υποομάδων και των υποομάδων ελέγχου. Ωστόσο, οι παρατηρούμενες αλλαγές στις κατακόρυφες μετρήσεις, Condylion/Go’ - Menton και στη διακονδυλική απόσταση, δε βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές. Επίσης, δεν εντοπίστηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στη βιοχημική ανάλυση, αναφορικά στα επίπεδα OPG, RANKL και MCSF. Επιπλέον, από την ιστολογική ανάλυση, προέκυψαν σημαντικές ιστομορφομετρικές διαφορές στον κόνδυλο της κάτω γνάθου. Συγκεκριμένα, η αναλογία Bone Surface/Total Surface (Επιφάνεια οστού/Συνολική επιφάνεια) βρέθηκε μειωμένη τόσο στην πρόσθια, όσο και στην οπίσθια περιοχή του κονδύλου. Σημαντική μείωση, ανιχνεύτηκε και στο πάχος της οπίσθιας χόνδρινης επιφάνειας του κονδύλου.Συμπεράσματα: 1.Η οπίσθια μετατόπιση της κάτω γνάθου σε αναπτυσσόμενους επίμυες αλλάζει τη μορφολογία της κάτω γνάθου και έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη μικρότερης κάτω γνάθου στην ενηλικίωση. 2.Η συγκεκριμένη ορθοδοντική/ορθοπεδική παρέμβαση δεν αποδείχτηκε να επηρεάζει τα επίπεδα των μελετημένων πρωτεϊνών στη συστηματική κυκλοφορία.3.Ιστολογικά, βρέθηκε να τροποποιείται η αρχιτεκτονική του οστού του κονδύλου και της χόνδρινης επιφάνειάς του.Η παρούσα πειραματική μελέτη έδωσε έμφαση στη μακροπρόθεσμη σταθερότητα των αποτελεσμάτων, αποκαλύπτοντας ότι η κάτω γνάθος δεν εμφανίζει υποτροπή αύξησης μετά τη θεραπεία.