Περιβαλλοντικά ελεγχόμενη οντογενετική και φαινοτυπική πλαστικότητα του zebrafish, Danio rerio (Hamilton 1882)

Abstract

Fish are considered as a highly plastic group of organisms, capable of modifying their phenotype in relation to environmental conditions (Meyer 1987, Snyder & Dingle 1990, Swain & Foote 1990, Baker et al. 2005, Kristjansson, 2005, Sharpe et al. 2008, Gonda et al, 2009). The term “phenotypic plasticity” characterizes the ability of a single genotype to produce a variety of phenotypes, as a response to the different environmental conditions experienced during development. Environmentally induced phenotypic differences can be a result of differences in developmental timing and environmental factors may act upon the overall growth pattern, affecting the timing of developmental events and having long-term effects. Those uniform changes in the rate, or in the relative timing of developmental events, are defined by the term heterochrony (Rice 1997, McNamara 1997, Klingenberg 1998, Smith 2002, McNamara 2012, Odentaal & Adriaens 2014, Gunter et al. 2014). Ontogenetic time, age and developmental stages, are used as milestones in studies concerning growth and differentiation and that is because those two parameters already contain the functional concept of time in their definition and therefore in their practical application. So, since this study concerns the environmentally induced plasticity and heterochrony in zebrafish, one of the objects of this study turned to be the most accurate way of determining the ontogenetic stages of the developing fish, in dpf / dph or SL / TL. The length of the body was used as the most appropriate indicator of the ontogenetic stages and results were extracted and analyzed in relation to it. From there on, the main purpose of this work was to study the effect of developmental temperature (from fertilization up until the completion of the stage of metamorphosis) in zebrafish, Danio rerio (Hamilton, 1822) phenotypic plasticity. The effect of temperature was examined in the sex ratio, the body shape of zebrafish larvae and adults, the timing of the ontogeny of meristic characters and the expression of genes associated with development (igf1, npy, myog, mstna, tnni2a. 3, osteocalcin, mgp, eda, cryaa, pes) and sex determination, directly or indirectly (ar, dmrt1, sox9a, cyp19a1a, cyp19a1b, figla, bmp15, gdf9, hsd11b2, tp53). Gene expression was studies during development (ontogenetic gene expression profile) (NanoString technologies), and secondarily in tissues of adult male and female zebrafish (igf1, npy, myog, mstna, tnni2a.3, ar, dmrt1, sox9a, cyp19a1a, cyp19a1b, figla, bmp15, gdf9) (Real Time q-PCR). The effect of population density and co-effect of temperature and photoperiod was also examined in the SGR, in the sex ratio of zebrafish, the shape of the body of adult males and females (only under the influence of density) and the timing of the ontogeny of the meristic characters (only under the co-effect of temperature and photoperiod). The ultimate goal was the intergraded study (to the limits of the possible) of environmentally controlled phenotypic plasticity, under the influence of the above environmental factors, and mostly under the influence of the critical developmental temperature. Each experiment was conducted twice. The temperature effect (22, 28 and 32°C) on zebrafish plasticity was examined throughout the whole larval period, from the 1st dpf, up until ≈14mm TL. Results demonstrated a significant affect od temperature conditions in sex ratio, with the 22°C shifting the ratio in favor of males and differentiating statistically significant from the two warmer temperature regimes (p <0,001 G-test). In order to study the effect of temperature on the timing of ontogenesis, the average SL50 in which each of the examined meristic characters developed, or each of the ontogenetic events (ossifications) completed, was estimated. The development of the following meristic characters, were examined: (1) the number of the pterygiophores of the anal fin (2) the number of the pterygiophores of the dorsal fin (3) ossification of the first pterygiophore of the pelvic fin (4) ossification of the first pterygiophore of the dorsal fin (5) development of urostyle (6) development of the first hypoural bone (7) development of the epural bone (8) ossification of the epural (9) development of pre-dorsals (10) development of the pelvic fins. 32°C accelerated the development of almost all meristic characters examined, except that of the epural, while possible heterochronic effects were observed, since when comparing individuals of the same thermal treatment among them, it is shown that at 28 and 32°C the development of the pelvic fins took place earlier than the ossification of the pterygiophores of the anal fin and the ossification of the epural, which is not the case at 22°C. Also, the development of urostyle preceded the development of pterygiophores of the anal fin at 22°C, while the opposite happened at 28°C. Geometric morphometric analysis revealed that developmental temperature significantly affected zebrafish larval body shape (Wilks' lambda = 0,0779, p <0,001), with CV1 and CV2 fully separating individuals grown under the three different temperature regimes. Fish body shape differences were established in adult female and male zebrafish, also (Wilks' lambda = 0,0315, p <0,001), with CV1 separating individuals based on their gender, and CV2 separating individuals developed at 22°C from the two warmer conditions. Thermo-dependent differences in gene expression in adult zebrafish, were observed only in the expression of myogenin (higher in males of 22°C, compared to 32°C) and cyp19a1a (lower in males of 22°C, compared to 32°C) (Mann-Whitney U test, p <0,05). Other gene expression differences concerned sex determination genes and were linked to the expected differences between females and males. In the study of the ontogenetic profiles of gene expression, results concerning osteocalcin and tnni2a.3 (associated with bone and muscle development, respectively), are considered of great importance. Reduced developmental temperature resulted in a significant displacement of the change of the expression pattern that was observed, to a greater body length (t-test, p <0,01), confirming a partial decoupling of growth rate from differentiation rate, under the influence of temperature. The sensitivity of zebrafish against the effect of temperature was studied, in order to reveal the importance of the time that temperature during development acts, as well as if the duration of temperature effect has profound additive effect on the occurrence of plasticity. This was done by comparing the results related to the effect of developmental temperature (22, 28, 32°C) in adult female and male zebrafish body shape from the study of Georga & Koumoundouros (2010) (Annex I), in which the effect of developmental temperature was studied in early and late ontogeny, with the respective results of this study, where developmental temperature (22, 28, 32°C) acted upon zebrafish over a time period that includes both ontogenetic periods examined in the work of Georga & Koumoundouros (2010). Results showed that the developmental period and hence the duration of the temperature effect are the factors primarily distinguishing experimental populations of the different temperature regimes, and secondarily developmental temperature itself. In regard to the effect of density on zebrafish the plasticity, two experiments were designed. The first studied the effect of population density in the early ontogenetic stages, up until ≈10 mm TL, while the second studied the effect of density after the body length of the fish reached ≈8 mm TL. Results showed statistically significant differences (G-test, p <0,05) in growth rate, only within the same density conditions, between the first and second phase of development, while the final sex ratio did not seem to be affected. The results of geometric morfometris demonstrated large differences in the final shaping of body shape, both among females and males, and among those developed in different density conditions. Concerning the experiment studying the co-effect of temperature and photoperiod in zebrafish plasticity, the following should be noted: Experimental populations were submitted under a combination of three temperature conditions (22, 28 και 32°C) with two photoperiod regimes (14:10, 8:16 L:D), from 1st dpf, up until ≈12-13 mm TL. Results demonstrated a significant co-effect of temperature and photoperiod on SGR (p<0.05), since at 14:10 L:D, larval SGR was linearly correlated with temperature, whereas at 8:16 L:D thermal effect on SGR was evident only at 22-28°C. Growth rate proved to be independent of photoperiod at low temperature conditions (22, 28°C, p> 0,05), while at 32°C increased photoperiod caused a significant increase in SGR (p <0,05). These observations were confirmed in both experimental repetitions. There was no co-effect of temperature and photoperiod regimes in the sex ratio of zebrafish, since only at the temperature condition of 22°C combined with photoperiod 14:10 (L:D) and in only one of the two experimental replicates statistically significant differences were observed in the in the sex ratio (G-test, p <0,05), with the percentage of females beinf significant lower than the percentage of males (31% vs. 69%) Finally, the ontogeny of the following meristic characters was studied: Notochord flexion, development of the anal fin (Anal), development of the dorsal fin (Dorsal), the completion of notochord flexion (Post-flexion), the completion of the formation of the caudal fork (Caudal) and the development of the pelvic fins (Abdominal). Within the same photoperiod treatment (14:10 L: D and 8:16 L: D), in almost all cases the increase of temperature from 22°C to 28 or at 32°C, caused an acceleration in the appearance or integration of each of the ontogenetic characters examined. Excluding the development of the pelvic fins at 22°C, in any other case the statistically significant differences observed between the same temperature conditions under the effect of different photoperiod regimes, was due to a delay on the onset or completion of their development in the photoperiod of 14:10 L: D, in relation to the photoperiod of 8:16 L: D.

Τα ψάρια αποτελούν μια ομάδα οργανισμών που εμφανίζει υψηλού βαθμού πλαστικότητα. Με τον ότο φαινοτυπική πλαστικότητα (phenotypic plasticity) χαρακτηρίζεται η ιδιότητα ενός γονοτύπου να παράγει διαφορετικούς φαινοτύπους, όταν εκτίθεται σε διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες (Stearns 1989, West-Eberhard 1989, West-Eberhard 2005, Pigliucci et al. 2006). Η περιβαλλοντικά προκλειόμενη φαινοτυπική πλαστικότητα μπορεί να εξεταστεί και υπό το πρίσμα του ετεροχρονισμού, ο οποίος ορίζεται ως μια «ομοιόμορφη αλλαγή στο ρυθμό ή στο χρονισμό μιας οντογενετικής διαδικασίας» (Rice 1997). Η μέτρηση του οντογενετικού χρόνου, της ηλικίας και ο καθορισμός του οντογενετικού σταδίου, αποτελούν ορόσημα κατά τη μελέτη του ρυθμού ανάπτυξης και διαφοροποίησης, παράγοντες που ήδη εμπεριέχουν τη λειτουργική έννοια του χρόνου στον ορισμό τους και την πρακτική εφαρμογή τους. Έτσι, επειδή στην παρούσα εργασία εξετάζεται η περιβαλλοντικά προκλειόμενη πλαστικότητα στο zebrafish, και η παρουσία ετεροχρονικών φαινομένων στην αλληλουχία της οντογένεσης, ένα από τα αντικείμενα της μελέτης βρέθηκε να αποτελεί και ο ακριβέστερος τρόπος προσδιορισμού των οντογενετικών σταδίων των ιχθύων σε dpf / dph ή SL / TL. Το μήκος του σώματος θεωρήθηκε ως το ιδανικότερο για τον προσδιορισμό των οντογενετικών σταδίων και σχετικά αποτελέσματα εξάχθηκαν και αναλύθηκαν σε σε συνάρτηση με αυτό. Απο ‘κει και πέρα, ο κύριος όγκος της παρούσας εργασίας αφορά στην επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (από τη γονιμοποίηση μέχρι και την ολοκλήρωση της μεταμόρφωσης) στη φαινοτυπική πλαστικότητα του zebrafish, Danio rerio (Hamilton, 1822). Η επίδραση της θερμοκρασίας εξετάστηκε στην αναλογία φύλου, στο σχήμα του σώματος των νυμφών και των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish, στο χρονισμό της οντογένεσης των μεριστικών χαρακτήρων και στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη (igf1, npy, myog, mstna, tnni2a.3, osteocalcin, mgp, eda, cryaa, pes) και το φυλοκαθορισμό, άμεσα ή έμμεσα (ar, dmrt1, sox9a, cyp19a1a, cyp19a1b, figla, bmp15, gdf9, hsd11b2, tp53) κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης (οντογενετικό προφίλ έκφρασης γονιδίων) (με την τεχνολογία των NanoString), όσο και δευτερογενώς σε ιστούς ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων (igf1, npy, myog, mstna, tnni2a.3, ar, dmrt1, sox9a, cyp19a1a, cyp19a1b, figla, bmp15, gdf9) (με τη μέθοδο της Real Time q-PCR). Επίσης, εξετάζεται η επίδραση της πληθυσμιακής πυκνότητας και της συνεπίδρασης της θερμοκρασίας ανάπτυξης-φωτοπεριόδου στο SGR, στην αναλογία φύλου των zebrafish, στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων (μόνο υπό την επίδραση της πυκνότητας), και στο στο χρονισμό της οντογένεσης των μεριστικών χαρακτήρων (μόνο υπό τη συνεπίδραση θερμοκρασίας - φωτοπεριόδου). Στόχος ήταν μια όσο το δυνατόν πιο ολοκληρωμένη μελέτη της περιβαλλοντικά ελεγχόμενης φαινοτυπική πλαστικότητας του είδους, υπό την επίδραση των παραπάνω περιβαλλοντικών παραγόντων, με κύριο τη θερμοκρασία ανάπτυξης. Κάθε πείραμα διεξήχθει σε δύο πειραματικές επαναλήψεις. Στο πείραμα επίδρασης της θερμοκρασίας στην πλαστικότητα του zebrafish, η θερμοκρασία (22, 28 και 32°C) επέδρασε καθόλη τη διάρκεια του εμβρυικού και νυμφικού σταδίου, μέχρι και τη μεταμόρφωση (1η dpf μέχρι ~14mm TL). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι στη θερμοκρασία των 22°C η αναλογία φύλου μετατοπίστηκε υπέρ των αρσενικών ατόμων, με τα ποσοστά των θηλυκών ατόμων (21,65% και 26,19% για την πρώτη και τη δεύτερη πειραματική επανάληψη, αντίστοιχα) να είναι σημαντικά χαμηλότερα σε σχέση με τους 28°C (50,83% και 54,22% για την πρώτη και τη δεύτερη πειραματική επανάληψη, αντίστοιχα) (p<0,001 G-test) και τους 32°C (47,24% και 56,80% για την πρώτη και τη δεύτερη πειραματική επανάληψη, αντίστοιχα) (p<0,001 G-test). Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση της θερμοκρασίας στο χρονισμό της οντογένεσης, καταγράφηκε το μέσο SL50 στο οποίο ολοκληρώνεται η εμφάνιση–ανάπτυξη των ακόλουθων οντογενετικών χαρακτήρων / γεγονότων: πρώτο υπουραίο οστό, επουραίο οστό, αριθμός των πτερυγιοφόρων του ραχιαίου πτερυγίου, αριθμός των πτερυγιοφόρων του εδρικού πτερυγίου, προραχιαία οστά, ουρόστυλο, κοιλιακά πτερύγια, και οστεοποίηση του πρώτου πτερυγιοφόρου του εδρικού πτερυγίου, του πρώτου πτερυγιοφόρου του ραχιαίου πτερυγίου, και του επουραίου. Η θερμοκρασία των 32°C επιτάχυνε την ανάπτυξη όλων σχεδόν των μεριστικών χαρακτήρων, με εξαίρεση αυτή του επουραίου οστού, ενώ παρατηρήθηκαν πιθανά ετεροχρονικά φαινόμενα που διαφοροποιούν τους 22°C, από τους 28 και 32°C και αφορούν στην αλληλουχία της ανάπτυξης των εξεταζόμενων οντογενετικών χαρακτήρων. Η ανάλυση γεωμετρικής μορφομετρίας έδειξε ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης επέδρασε στο σχήμα του σώματος των νυμφών zebrafish (Wilks' λ=0,0779, p<0,001), με τις δύο κανονικές μεταβλητές (CV1 and CV2) να διαχωρίζουν πλήρως τα άτομα των τριών θερμοκρασιακών συνθηκών, ενώ επέδρασε σημαντικά και στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων (Wilks' λ=0,0315, p<0,001), με τη CV1 να διαχωρίζει τα άτομα με βάση το φύλο τους, και τη CV2 να διαχωρίζει τα άτομα αναπτύχθηκαν στους 22°C από τα άτομα των δύο θερμότερων συνθηκών. Θερμο-εξαρτώμενες διαφορές στη γονιδιακή έκφραση, των ενήλικων zebrafish, παρατηρήθηκαν μόνο στην έκφραση της myogenin (υψηλότερη στα αρσενικά των 22°C, σε σχέση με των 32°C) και της cyp19a1a (χαμηλότερη στα αρσενικά των 22°C, σε σχέση με των 32°C) (Mann-Whitney U test, p<0,05). Οι υπόλοιπες διαφορές αφορούσαν στα φυλοκαθοριστικά γονίδια και συνδέονταν με τις αναμενόμενες διαφοροποιήσεις μεταξύ των θηλυκών και αρσενικών ατόμων. Κατά τη μελέτη του οντογενετικού προφίλ της έκφρασης των υπό μελέτη γονιδίων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, ως εξαιρετική σημασίας θα αναφερθούν τα αποτελέσματα που αφορούν στα γονίδια osteocalcin και tnni2a.3, που συνδέονται με την ανάπτυξη των οστών και των μυών αντίστοιχα. Μείωση της θερμοκρασίας ανάπτυξης, έχει ως αποτέλεσμα την μετατόπιση της αλλαγής του προτύπου της έκφρασης αυτών των γονιδίων σε μεγαλύτερο μήκος σώματος (t-test, p<0,01), επιβεβαιώνοντας τη μερική αποσύνδεση του ρυθμού αύξησης από το ρυθμό διαφοροποίησης, υπό την επίδραση της θερμοκρασίας. Επίσης, μελετήθηκε η ευαισθησία των zebrafish έναντι της επίδρασης της θερμοκρασίας ανάπτυξης, ανάλογα με το αναπτυξιακό στάδιο στο οποίο δρα η θερμοκρασία και ανάλογα με το συνολικό χρόνο δράσης της. Αυτό πραγματοποιήθηκε συγκρίνοντας τα αποτελέσματα που αφορούν στην επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (22, 28, 32°C) στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish από την εργασία των Georga & Koumoundouros (2010) (Παράρτημα I) όπου μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης κατά την πρώιμη και κατά την όψιμη οντογενετική περίοδο στο σχήμα του σώματος των ενήλικων ατόμων, με αυτά της παρούσας εργασίας, όπου η δράση της θερμοκρασίας (22, 28, 32°C) πραγματοποιήθηκε για χρονικό διάστημα που περιλαμβάνει τις δύο οντογενετικές περιόδους που εξετάζονται στην εργασία των Georga & Koumoundouros (2010). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η οντογενετική περίοδος και άρα η χρονική διάρκεια επίδρασης της θερμοκρασίας είναι αυτή που πρωτίστως διαχωρίζει τους πειραματικούς πληθυσμούς, και δευτερευόντως η θερμοκρασία ανάπτυξης. Σε ό,τι αφορά στην επίδραση της πυκνότητας στην πλαστικότητα του zebrafish, σχεδιάστηκαν δύο πειράματα. Το πρώτο μελετούσε την επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού κατά τα πρώιμα οντογενετικά στάδια και μέχρι τα ≈10 mm TL, ενώ το δεύτερο μελετούσε την επίδραση της πυκνότητας μετά από μήκος σώματος 8 mm TL. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορες στην αύξηση (G-test, p<0,05) μόνο εντός των ίδιων συνθηκών πυκνότητας μεταξύ της πρώτης και της δεύτερης φάσης ανάπτυξης, ενώ η τελική αναλογία φύλου δε φαίνεται να επηρεάστηκε. Τα αποτελέσματα της γεωμετρικής μορφομετρίς, κατέδειξαν μεγάλες διαφορές στην τελική διαμόρφωση του σχήματος του σώματος, τόσο μεταξύ των θηλυκών και αρσενικών ατόμων, όσο και μεταξύ των ατόμων που αναπτύχθηκαν στις διαφορετικές συνθήκες πυκνότητας. Εφαρμόστηκαν έξι συνδυασμοί θερμοκρασίας νερού (22, 28, 32°C) και φωτοπεριόδου (14:10, 8:16 L:D) από την 1η dpf μέχρι τα 12-13 mm ΤL. Τα αποτελέσματα υπέδειξαν σημαντική συνεπίδραση της θερμοκρασίας και της φωτοπερίοδου στο SGR (p<0,05). Στη φωτοπερίοδο 14:10 L:D ο SGR αυξήθηκε γραμμικά με την αύξηση της θερμοκρασίας και στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες (22, 28, 32°C), ενώ στη φωτοπερίοδο 8:16 L:D ο SGR επηρεάστηκε σημαντικά μόνο στο εύρος των 22-28°C. Ο ρυθμός αύξησης του ολικού μήκους αποδείχθηκε ανεξάρτητος της φωτοπεριόδου στις χαμηλές θερμοκρασιακές συνθήκες (22, 28˚C, p>0,05), ενώ στους 32˚C η αύξηση της φωτοπεριόδου προκάλεσε σημαντική αύξηση του SGR (p<0,05). Οι παραπάνω παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν και στις δύο πειραματικές επαναλήψεις. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η θερμοκρασία και η φωτοπερίοδος συνεπιδρούν στο ρυθμό σωματικής αύξησης, με τον καθένα από αυτούς να ελέγχει τη δράση του άλλου. Μόνο στην θερμοκρασία των 22°C σε συνδυασμό με την φωτοπερίοδο 14:10 (L:D) και στη μία εκ των δύο πειραματικών επαναλήψεων, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά (G-test, p<0,05) στην αναλογία φύλου, με τα θηλυκά άτομα να είναι λιγότερα από τα αρσενικά (31% θηλυκά έναντι 69% αρσενικά zebrafish) (Εικόνα 4.4.2 1, Πίνακας 26). Τέλος, εξετάστηκε η οντογένεση των ακόλουθων μεριστικών χαρακτήρων: Αρχή κάμψης της νωτοχορδής (Flexion), εμφάνιση του εδρικού πτερυγίου (Anal), εμφάνιση του ραχιαίου πτερυγίου (Dorsal), ολοκλήρωση κάμψης της νωτοχορδής (Post-flexion), ολοκλήρωση του σχηματισμού της ουραίας διχάλας (Caudal) και εμφάνιση προπλασμάτων των κοιλιακών πτερυγίων (Abdominal). Εντός της ίδιας συνθήκης φωτοπεριόδου (14:10 L:D και 8:16 L:D), σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις, αύξηση της θερμοκρασίας από τους 22°C στους 28 ή στους 32°C, προκάλεσε επιτάχυνση της εμφάνισης – ολοκλήρωσης των εκάστοτε οντογενετικών χαρακτήρων. Με εξαίρεση την ανάπτυξη του εδρικού πτερυγίου στους 22°C, σε κάθε άλλη περίπτωση που παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των ίδιων θερμοκρασιών στις διαφορετικές συνθήκες φωτοπεριόδου, αυτή οφειλόταν σε καθυστέρηση της εμφάνισης ή της ολοκλήρωσης της ανάπτυξής τους στη μεγάλη φωτοπερίοδο, σε σχέση με τη μικρή.