Αυτο-οργανούμενες νανοδομές συμπολυμερών κατά συστάδες για εγκλωβισμό/ελεγχόμενη αποδέσμευση φαρμάκων, γονιδίων και πρωτεϊνών για βιολογικές εφαρμογές

Abstract

Amphiphilic copolymers attract the scientific interest due to their characteristic molecular structure, to their unique property to self-assemble in aqueous solutions into complex structures and their intriguing physicochemical features, which allows their utilization in biomedical applications.Double-hydrophilic polyelectrolyte copolymers, on the other hand, display great scientific interest in terms of their synthesis and unique properties, as they combine the structural properties of polyelectrolytes, double-hydrophilic copolymers and surfactants. Nano-drug delivery systems based on amphiphilic and double-hydrophilic copolymers have revolutionized drug, gene, and protein delivery in the last few decades, endowing drugs with increased stability and water solubility, prolonging their circulation time, enhancing the uptake rate of target cells or tissues, reducing enzyme and therapeutic protein/peptide degradation and controlling the release of the drug.In the present doctoral thesis, five different systems of amphiphilic and double-hydrophilic copolymers were synthesized and were further utilized for the development of novel, highly-stable drug/gene/protein polymeric nanocarriers. Specifically, two amphiphilic diblocks and one gradient copolymer namely the PnBA-b-POEGA, PEO-b-PCL and PPhOxz-grad-PMeOxz copolymers were synthesized by RAFT, CROP and cationic polymerization, respectively. Amphiphilic copolymer micelles served as the nanocarriers for the subsequent encapsulation of the hydrophobic drug losartan (LSR) into the hydrophobic core of PnBA, PCL and PPhOxz. Furthermore, four biocompatible block POEGMA-b-PVBTMAC and statistical P(OEGMA-co-VBTMAC) copolymers were synthesized by RAFT and were further used for the design of biocompatible insulin (INS) nanocarriers. Moreover, multifunctional hybrid spherical-shaped nanostructures, formed by a double-hydrophilic POEGMA-b-PVBTMAC block copolymer synthesized by RAFT, hydrophilic MNPs and short linear DNA, were subsequently developed and studied.The molecular characteristics of PnBA-b-POEGA, POEGMA-b-PVBTMAC and P(OEGMA-co-VBTMAC) copolymers were determined by SEC and 1H-NMR, underlying the success and controlled nature of thepolymerization process. The structural and physicochemical characterization both of copolymers and polymeric nanocarriers was studied in aqueous media using DLS, SLS, ELS, ATR-FTIR, UV-Vis, FS, 1D-2D NMR and Cryo-TEM techniques. Physicochemical results of copolymer/drug solutions and copolymer/INS complexes confirmed the presence of LSR in the PnBA-b-POEGA, PEO-b-PCL and PPhOxz-grad-PMeOxz nanoassemblies and the efficient complexation of INS with POEGMA-b-PVBTMAC and P(OEGMA-co-VBTMAC) polyelectrolytes. In addition, FBS interactions with copolymers, copolymer/drug solutions, and copolymer/INS complexes manifested a very good stability of copolymer nanostructures and nanocarriers into a biological environment. 2D-NOESY experiments of PnBA-b-POEGA, PEO-b-PCL and PPhOxz-grad-PMeOxz copolymers evidenced strong intermolecular interactions between copolymers and LSR moieties, documenting the successful encapsulation of LSR into the micelles. According to Cryo-TEM results, the POEGMA-b-PVBTMAC and P(OEGMA-co-VBTMAC) copolymers formed aggregates and threadlike structures after their complexation with INS molecules. Magnetophoretic experiments verified that the MNPs maintain their magnetic properties after their complexation with the copolymer and nucleic acids, enriching the hybrid ternary complexes with magnetic field responsiveness.

Τα αμφίφιλα συμπολυμερή αποτελούν ένα ευρύ και σημαντικό αντικείμενο έρευνας για βιολογικές εφαρμογές, λόγω της χαρακτηριστικής μοριακής τους δομής, της ιδιαίτερης αυτο-οργάνωσής τους σε πολύπλοκες δομές και των ιδιαίτερων φυσικοχημικών ιδιοτήτων που παρουσιάζουν όταν εισαχθούν σε κατάλληλο διαλύτη. Τα διυδρόφιλα συμπολυμερή πολυηλεκτρολυτικού τύπου από την άλλη μεριά, αποτελούν ένα αρκετά ενδιαφέρον αντικείμενο έρευνας ως προς την σύνθεση και τις μοναδικές ιδιότητές τους, καθώς συνδυάζουν τα δομικά χαρακτηριστικά των πολυηλεκτρολυτών, των διυδρόφιλων συμπολυμερών και των επιφανειοδραστικών ουσιών. Τα νανοσυστήματα μεταφοράς φαρμάκων, γονιδίων και πρωτεϊνών βασισμένα σε αμφίφιλα και διυδρόφιλα συμπολυμερή έχουν φέρει επανάσταση στη φαρμακευτική έρευνα και ανάπτυξη τις τελευταίες δεκαετίες, προσδίδοντας στα φάρμακα αυξημένη σταθερότητα και υδατοδιαλυτότητα, παρατείνοντας τον χρόνο κυκλοφορίας τους, ενισχύοντας τον ρυθμό πρόσληψής τους από τα κύτταρα-ιστούς στόχους, μειώνοντας την αποικοδόμηση των εγκλωβισμένων ενζύμων και θεραπευτικών πρωτεϊνών/πεπτιδίων και ελέγχοντας την απελευθέρωση του φαρμάκου.Στη παρούσα διδακτορική διατριβή, αρχικά συντέθηκαν πέντε διαφορετικά συστήματα αμφίφιλων και διυδρόφιλων συμπολυμερών σε διαφορετικές χημικές συστάσεις και μετέπειτα χρησιμοποιήθηκαν για τον σχεδιασμό καινοτόμων πολυμερικών φαρμακευτικών, γονιδιακών και πρωτεϊνικών νανοφορέων. Ειδικότερα, πραγματοποιήθηκε η σύνθεση δύο αμφίφιλων δισυσταδικών συμπολυμερών του τύπου PnBA-b-POEGA μέσω RAFT και PEO-b-PCL μέσω CROP καθώς και ενός αμφίφιλου PPhOxz-grad-PMeOxz βαθμωτού συμπολυμερούς μέσω κατιοντικού πολυμερισμού. Τα αμφίφιλα συμπολυμερή χρησιμοποιήθηκαν ως μικκυλιακοί φορείς για τον εγκλωβισμό του υδρόφοβου φαρμάκου λοζαρτάνη (LSR) στον υδρόφοβο πυρήνα του PnBA, της PCL και της PPhOxz αντίστοιχα. Στη συνέχεια, συντέθηκαν μέσω RAFT τέσσερα διυδρόφιλα POEGMA-b-PVBTMAC δισυσταδικά και P(OEGMA-co-VBTMAC) στατιστικά συμπολυμερή, που μετέπειτα χρησιμοποιήθηκαν για τον σχεδιασμό νανοφορέων ινσουλίνης (INS). Κατόπιν, το POEGMA-b-PVBTMAC δισυσταδικό συμπολυμερές χρησιμοποιήθηκε περαιτέρω για την ανάπτυξη πολυλειτουργικών νανοδομώνμέσω της ηλεκτροστατικής συμπλοκοποίησης αρχικά με υδρόφιλα ανόργανα μαγνητικά νανοσωματίδια (MNPs) και μετέπειτα με DNA.Τα μοριακά χαρακτηριστικά των PnBA-b-POEGA, POEGMA-b-PVBTMAC και P(OEGMA-co-VBTMAC) συμπολυμερών προσδιορίστηκαν μέσω SEC και 1H-NMR, διαπιστώνοντας την επιτυχημένη και ελεγχόμενη διαδικασία πολυμερισμού. Ο δομικός και φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των συμπολυμερών και πολυμερικών νανοφορέων σε υδατικά μέσα μελετήθηκε χρησιμοποιώντας τις τεχνικές DLS, SLS, ELS, ATR-FTIR, UV-Vis, FS, 1D-2DNMR και Cryo-TEM. Τα φυσικοχημικά αποτελέσματα των διαλυμάτων συμπολυμερούς/φαρμάκου και των συμπλόκων συμπολυμερούς/INS επιβεβαίωσαν την παρουσία LSR στα μικκύλια των PnBA-b-POEGA, PEO-b-PCL και PPhOxz-grad-PMeOxz και κατέδειξαν την αποτελεσματική συμπλοκοποίηση της INS με τα συμπολυμερή POEGMA-b-PVBTMAC και P(OEGMA-co-VBTMAC). Επιπλέον, οι αλληλεπιδράσεις FBS με τα συμπολυμερή, τα διαλύματα συμπολυμερούς/φαρμάκου και τα σύμπλοκα συμπολυμερούς/INS κατέδειξαν μια πολύ καλή σταθερότητα των νανονοδομών συμπολυμερούς και των νανοφορέων σε βιολογικό περιβάλλον. Τα πειράματα 2D-NOESY των PnBA-b-POEGA, PEO-b-PCL και PPhOxz-grad-PMeOxz συμπολυμερών κατέδειξαν ισχυρές διαμοριακές αλληλεπιδράσεις μεταξύ της LSR με συγκεκριμένα πρωτόνια των συμπολυμερών, επιβεβαιώνοντας την ενθυλάκωση της LSR στα πολυμερικά μικκύλια. Σύμφωνα με τις μετρήσεις Cryo-TEM, τα POEGMA-b-PVBTMAC και P(OEGMA-co-VBTMAC) συμπολυμερή σχημάτισαν συσσωματώματα και νηματοειδείς δομές μετά την συμπλοκοποίησή τους με INS. Τα MNPs νανοσωματίδια διατήρησαν τις μαγνητικές τους ιδιότητες μετά τη συμπλοκοποίησή τους με το συμπολυμερές και τα νουκλεϊκά οξέα, καθιστώντας τα τριμερή υβριδικά σύμπλοκα αποκρίσιμα σε εξωτερικά εφαρμοζόμενα μαγνητικά πεδία.