Αποσαφηνίζοντας το ρόλο της ορμόνης του στρες εκλυτική ορμόνη της κορτικοτροπινης (Corticotropin Releasing Hormone, CRH) στην αναγέννηση και τη διατήρηση της ομοιόστασης του εντερικού επιθηλιακού φραγμού

Abstract

The collapse of the intestinal epithelial barrier homeostasis, also known as the leaky- gut syndrome, has been associated with many chronic inflammatory conditions, including the Inflammatory Bowel Disease (IBD). IBD is characterized by chronic inflammation of different areas of the gastrointestinal tract, with intermittent periods of remission and relapse of the disease activity. On the very early phase of IBD, the disruption of the intestinal epithelial barrier integrity allows the commensal bacteria and antigens to translocate in the submucosal area and trigger the reaction of the innate immune system. Despite the fact that the causality of the disease has not been fully deciphered, it is known that both environmental and genetic factors contribute to its initiation. Corticotropin Releasing Hormone (CRH) is the hormone responsible for the mitigation of the stress response, with a well-documented immunoregulatory action on both systemic and tissue specific level. Here, we aim to assess the role of CRH in the regeneration of the intestinal epithelium upon exposure to injury insults. For this purpose, we applied the DSS induced experimental colitis model in Crh-/- mice. We show that Crh-/- mice exert severe acute inflammatory response, followed by increased lethality and impaired tissue regeneration after the removal of DSS. Moreover, we detect increased expression of IL-6, as well as an altered composition of the gut microbiome under baseline conditions, indicating the presence of a dysbiotic environment. Acknowledging the implication of autophagy and inflammasome in the communication of the intestinal microflora with the epithelial barrier, we next assessed the interaction of CRH with these cellular mechanisms. Interestingly, the levels of LC3, a well-established marker indicating activation of autophagy, revealed increased autophagy levels under baseline conditions and in the absence of CRH, sustained over the course of the experimental disease. Inhibition of autophagy, using the pharmacological agent 3-Methyladenine, resulted in increased survival and limited immune response of the Crh-/- mice upon termination of the DSS treatment. In parallel, we confirmed the negative interaction between CRH and the autophagy signaling pathways in vitro using amino acids deprivation in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) and LPS treatment of the mouse macrophages cell line, Raw264.7. Aligned with the previous findings was the increased expression of the inflammasome component NLRP6, responsible for sensing of microbial metabolites, and its downstream targets under baseline conditions. Administration of antibiotics for 10 days prior and during the DSS treatment, abrogated the increased lethality of Crh-/- mice and significantly ameliorated the tissue regeneration. Based on our findings, we propose that CRH controls fundamental homeostatic mechanisms of the intestinal tissue under baseline and inflammatory conditions. Taking also into account its increased expression in the colon tissue of IBD patients, we underlie the significance of the CRH signaling pathway for the identification of therapeutic targets at different stages of the human disease. However, considering the limited translatability of the animal-based studies from bench to the patient bedside, we attempted to establish a platform that would allow for the ex vivo culture and experimentation on human derived colonic epithelial cells. Hence, we combined recent advancements of the organoids and Organ-on-Chip technology to establish the Colon Intestine-Chip. The newly developed platform emulates the mechanical forces and the extracellular matrix components of the human tissue. Transcriptomic analysis, using RNA sequencing, revealed the significance of endothelium on the structural and functional maturation of intestinal epithelium ex vivo. The Colon Intestine-Chip allowed the multi-lineage differentiation of the biopsy derived colonoids, whereas its periodic exposure to air, reminiscent of the periodicity of the food chyme transition, enhanced the differentiation of Goblet cells. We provide evidence that the Colon Intestine-Chip platform responds to interferon gamma (IFNγ), a prototype cytokine utilized to model inflammation-induced barrier disruption, by induction of apoptosis and reorganization of the apical junctional complexes as shown with other systems. The IFNγ mediated cytokine secretion across the three healthy donors applied, reflects the expected donor-to-donor variability, supporting the potential use of the Colon Intestine-Chip as a precision medicine tool. We also describe the mechanism of action of interleukin 22 (IL-22) on mature, organoid-derived intestinal epithelial cells that is consistent with barrier disruption in contrast to the previously described barrier protective action. Overall, we propose the Colon Intestine-Chip as a promising human organoid-derived platform to decipher mechanisms driving the development of leaky gut in patients and enable their translation for this unmet medical need.

Η διατάραξη της ομοιόστασης του εντερικού επιθηλιακού φραγμού έχει συσχετιστεί με πληθώρα φλεγμονωδών διαταραχών του εντερικού ιστού, συμπεριλαμβανομένης και της Ιδιοπαθούς Φλεγμονώδους Νόσου του Εντέρου (ΙΦΝΕ). Με τον όρο ΙΦΝΕ αναφερόμαστε σε χρόνιες φλεγμονώδεις διαταραχές οι οποίες χαρακτηρίζονται από χρόνια υποτροπιάζουσα ανοσολογική ενεργοποίηση και φλεγμονή του γαστρεντερικού σωλήνα. Η έναρξη της νόσους είναι συχνά συνυφασμένη με την κατάρρευση της ακεραιότητας του επιθηλιακού φραγμού και την εισβολή των βακτηρίων και περιβαλλοντικών αντιγόνων του αυλού στην υποβλεννογόνο περιοχή, με αποτέλεσμα την έναρξη ανοσολογικής απόκρισης. Τα αίτια του φαινομένου αυτού δεν έχουν πλήρως διαλευκανθεί, είναι γνωστό όμως η νόσος έχει τόσο γενετικό όσο και περιβαλλοντικό υπόβαθρο. Η ορμόνη CRH συμμετέχει στη ρύθμιση της ανοσολογικής αντίδρασης σε συστημικό καθώς και σε ιστοειδικό επίπεδο. Στην παρούσα διατριβή στοχεύσαμε στη διαλεύκανση του ρόλου της CRH στην πορεία της ιστικής αναγέννησης κάτω από παθολογικές συνθήκες, χρησιμοποιώντας το πειραματικό μοντέλο της DSS επαγόμενης κολίτιδας σε μύες. Οι Crh-/-, σε συμφωνία με προηγούμενα ευρήματα της ομάδας, εμφανίζουν εκτεταμένη φλεγμονή, αυξημένη θνησιμότητα και αδυναμία επιδιόρθωσης του ιστού. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι πριν την έναρξη της φλεγμονώδους διαδικασίας εμφανίζουν υψηλά επίπεδα IL-6, ενώ η ποιοτική και ποσοτική σύσταση της εντερικής χλωρίδας υποδεικνύει την ύπαρξη δυσβιωτικού περιβάλλοντος. Γνωρίζοντας τη σημασία των μηχανισμών της αυτοφαγίας και του inflammasome στην αλληλεπίδραση του βλεννογόνου με τα εντερικά βακτήρια, εν συνεχεία μελετήσαμε τη ρύθμιση αυτών των μηχανισμών σε συνθήκες γενετικής απαλοιφής της CRH. Χρησιμοποιώντας την πρωτεΐνη LC3 σαν δείκτη ενεργοποίησης του αυτοφαγικού μηχανισμού, διαπιστώσαμε την αυξημένη ενεργότητα της αυτοφαγίας σε συνθήκες ελέγχου καθώς και σε όλη τη διάρκεια της πειραματικής νόσου. Η φαρμακολογική αναστολή της αυτοφαγίας με τον αναστολές της 3-Methyladenine, οδήγησε σε αύξηση του προσδόκιμου επιβίωσης των Crh -/- μυών μετά την παύση της χορήγησης του DSS, ενώ περιόρισε την ανεξέλεγκτη έκκριση κυτοκινών. Η αρνητική συσχέτιση της σηματοδότησης της CRH με την αυτοφαγία επιβεβαιώθηκε και in vitro σε εμβρυονικούς ινοβλάστες μυός (Mouse Embryonic Fibroblasts, MEFs), έπειτα από στέρηση αμινοξέων, και σε μακροφάγα μυός Raw264.7, έπειτα από χορήγηση LPS. Σε συμφωνία με το αυξημένο μικροβιακό φορτίο των Crh-/- πριν την έναρξη της φλεγμονής, ανιχνεύσαμε αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης του inflammasome NLRP6, υπεύθυνης για την ανίχνευση μικροβιακών μεταβολιτών, καθώς και των καθοδικών της στόχων σε συνθήκες ελέγχου. Η χορήγηση αντιβιοτικών ευρέως φάσματος για 10 ημέρες πριν αλλά και καθ’ όλη τη διάρκεια της χορήγησης DSS, είχε ως αποτέλεσμα τo θεαματικό περιορισμό της φλεγμονώδους αντίδρασης στους Crh -/- μύες, την αυξημένη επιβίωση τους και την πλήρη ιστική επιδιόρθωση. Με βάση τα ευρήματα της παρούσας μελέτης, αποδεικνύουμε πως η CRH ρυθμίζει βασικούς ομοιοστατικούς μηχανισμούς του εντερικού ιστού σε συνθήκες ελέγχου και έπειτα από επαγωγή φλεγμονής. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με την αυξημένη έκφραση της CRH στο παχύ έντερο ασθενών με ΙΦΝΕ, υπογραμμίζει τη σημασία της απόκρισης στο στρες για την εξέλιξη της ανθρώπινης νόσου και παρέχει στόχους για θεραπευτικές προσεγγίσεις, ανάλογα με το στάδιο και την πορεία της φλεγμονής. Παρ’ όλα αυτά και αξιολογώντας την περιορισμένη μετάφραση των πειραματικών δεδομένων από ζωικά μοντέλα στην κλινική πράξη, επιδιώξαμε την ανάπτυξη μίας πλατφόρμας, που θα επιτρέπει την ex vivo καλλιέργεια και πειραματισμό σε ανθρώπινα κύτταρα παχέος εντέρου. Για το σκοπό αυτό συνδυάσαμε τις τεχνολογίες των οργανοειδών και των Organ-on-Chip, με αποτέλεσμα την ανάπτυξη του Colon Intestine-Chip, το όποιο προσομοιάζει τις μηχανικές πιέσεις και το περιβάλλον της εξωκυττάριας ουσίας, όπως αυτά απαντώνται στον ανθρώπινο εντερικό ιστό. Ανάλυση του μεταγραφώματος με χρήση RNA sequencing κατέδειξε τη σημασία του ενδοθηλίου στη μορφολογική και λειτουργική ωρίμανση του εντερικού επιθηλιακού φραγμού ex vivo. Το Colon Intestine-Chip επέτρεψε τη διαφοροποίηση των οργανοειδών προς τις δύο εντερικές επιθηλιακές κυτταρικές σειρές. Παράλληλα, η περιοδική έκθεση των επιθηλιακών κυττάρων σε αέρα, ανάλογη της εναλλασσόμενης έκθεσης του βλεννογόνου στον τροφικό χυμό, ενίσχυσε τη διαφοροποίηση των καλυκοειδών κυττάρων. Έκθεση του Colon Intestine-Chip στην προφλεγμονώδη κυτοκίνη IFNγ, γνωστή για τη δράση της στη διάσπαση του επιθηλιακού φραγμού, οδήγησε σε απόπτωση των επιθηλιακών κυττάρων και καταστροφή των στενοσυνδέσμων, προκαλώντας αύξηση της επιθηλιακής παρακυτταρικής διαπερατότητας. Η απελευθέρωση κυτοκινών από τρεις διαφορετικούς δότες, παρουσία του φλεγμονώδους ερεθίσματος, αντικατόπτρισε το εύρος των αποκρίσεων που απαντώνται στην κλινική πράξη. Το γεγονός αυτό υπογραμμίζει τη δυνατότητα εφαρμογής της πλατφόρμας στο πεδίο της εξατομικευμένης ιατρικής. Τέλος, διαπιστώσαμε την κατάρρευση της ακεραιότητας του επιθηλιακού φραγμού έπειτα από χορήγηση της κυτοκίνης IL-22. Συγκρίνοντας τα ευρήματα της παρούσας μελέτης με αυτά πρότερων μελετών που υποστηρίζουν την αντιφλεγμονώδη δράση της IL-22, κατανοούμε τη σημασία των ειδικών χαρακτηριστικών του εκάστοτε πειραματικού μοντέλου στην κατανόηση του μηχανισμού δράσης των κυτοκινών και υποστηρίζουμε τη δυνατότητα χρήσης του Colon Intestine-Chip στη μελέτη των μηχανισμών που διέπουν τη διάσπαση και αναγέννηση του εντερικού επιθηλιακού φραγμού.