Μοριακοί μηχανισμοί γενετικής αστάθειας στον καρκίνο του παχέος εντέρου στον άνθρωπο: ο ρόλος της σηματοδότησης από την integrin-linked-kinase (ILK)

Abstract

Introduction Colon cancer is a major cause of morbidity and mortality worldwide. Errors in DNA replication and chromosome segregation lead to genomic instability, a crucial feature in tumor development and progression. Increasing evidence suggest that oncogene-induced replication stress represents a major route to genomic instability in cancer cells. Genomic instability is of paramount significance in CRC development, progression and therapy resistance. There are at least two distinct pathways that lead to genomic instability in human CRC: the chromosomal instability (CIN) and the microsatellite instability (MSI) pathway. Most cases of CRC arise through the CIN pathway which is characterized by aneuploidy. CIN is generally thought to arise from chromosome misegregation due to defects in centrosomes, mitotic spindle formation and/or mitotic checkpoint control. Replication stress also generates numerical and structural chromosome defects in colon cancer. However, the definitive molecular basis of genomic instability in colon cancer remains elusive. Integrin linked kinase (ILK), a widely expressed serine/threonine protein kinase located in focal adhesions plays a central role as a multifunctional effector of growth factor signaling and cell-matrix interactions. Through its complex protein interactions and regulated kinase activity, ILK has been shown to control fundamental processes such as proliferation, survival, migration, invasion and epithelial to mesenchymal transition. ILK functions as an oncogene in human carcinogenesis and represents a novel anti-cancer therapeutic target. Previous studies have shown that ILK overexpression correlates with tumor progression in human colorectal cancer. Activation of β-catenin and Akt pathways as well as EMT probably mediates ILK functions in colorectal cancer progression. Apart for its function as a scaffold and kinase in focal adhesions, ILK is also shown to localize to the centrosomes and regulate microtubule dynamics and mitotic spindle organization, raising the possibility that mitotic spindle defects upon ILK overexpression may confer to genomic instability in colorectal cancer progression. However, the involvement of ILK overexpression in the mechanisms of genomic instability in colon cancer has not been previously addressed. The aim of this thesis was to evaluate the role of ILK in mechanisms of genomic instability in colon cancer. Material and methods We evaluated association of ILK expression with markers of genomic instability in human colon cancer cells and tissue samples. ILK expression in 79 colorectal carcinoma tissue samples was evaluated by immunohistochemistry. Markers of genomic instability (micronuclei formation, nucleus size and intensity) were investigated in diploid human colon cancer cells HCT116 upon ectopic ILK overexpression (transient transfection) by immunofluorescence and in human CRC samples by Feulgen staining. We also studied the role of ILK in centrosomes and mitotic spindle formation. The number and structure of centrosomes and mitotic spindle morphology upon ILK overexpression and pharmacologic inhibition in colorectal cancer cell lines was investigated by immunofluorescence using centrosome and mitotic spindle specific antibodies such as γ-tubulin and a-tubulin respectively. We also evaluated association of ILK overexpression with markers of DNA damage (p-H2AX, p-ATM/ATR) in human CRC tissue samples by immunohistochemistry and in ILK overexpressing cells by immunofluorescence. In order to determine whether ILK overexpression leads to apoptosis, we examined the expression of caspase-3 by immunofluorescence in ILK overexpressing cells We finally investigated association of ILK expression with proteins involved in DNA replication licensing including Geminin Cdt1 and Mcm7. For this purpose expression of licensing factors was investigated by immunohistochemistry in relation to ILK in human tissue samples as well as by RT-PCR and immunofluorescence in HCT16 cells upon ILK overexpression or inhibition. Results ILK is overexpressed in colon cancer and is localized in the nucleus and centrosomes of cancer cells. ILK overexpression is associated with markers of genomic instability both in vitro and in vivo in tissue samples. We also showed that ILK is involved in the mitotic spindle formation, as pharmacologic inhibition of ILK causes abnormal mitotic spindles, whereas cells overexpressing ILK fail to undergo Nocodazole-induced mitotic arrest. We further provided evidence that ILK overexpression is associated with DNA damage and / or replication stress, as there was a statistically significant difference in the expression of p-γ-H2AX protein between cells overexpressing ILK and control transfectants. Remarkably, ILK overexpressing cells seem to show an extensive damage to DNA as evidenced by p-γ-H2AX immunofluorescence showing a characteristic "pan-nuclear damage" signal. We further showed that ILK nuclear expression in human CRC tissue samples significantly correlated with the expression of p-H2AX and p-ATM/ATR substrate by immunohistochemistry and this correlation was dependent on 53 expression status. Despite DNA damage, ILK overexpressing cells do not undergo apoptosis. In addition, ILK overexpression in colorectal cancer cells significantly reduced the expression of GMNN and MCM-7 and appeared to increase, but not statistically significantly, the expression of Cdt-1. In contrast, inhibition of ILK activity does not appear to significantly affect the expression of GMNN, MCM-7 and Cdt-1 indices. Conclusions Our results support the hypothesis that overexpression of ILK in human colon cancer leads to DNA damage and genomic instability. In particular, we show that ILK overexpression in human CRC is associated with DNA damage, possibly related to replication stress, causing a phenotype of gene instability. These results suggest a novel role of ILK in human colorectal cancer.

Εισαγωγή O καρκίνος του παχέος εντέρου αποτελεί σημαντικό αίτιο νοσηρότητας και θνησιμότητας παγκοσμίως. Λάθη κατά την αντιγραφή του DNA και το διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων στη μίτωση, οδηγούν σε γονιδιωματική αστάθεια, που αποτελεί σημαντικό χαρακτηριστικό στην ανάπτυξη και εξέλιξη του όγκου. Αυξανόμενες ενδείξεις καταδεικνύουν ότι το αντιγραφικό στρες που προκαλείται από ογκογονίδια αποτελεί μια σημαντική οδό γονιδιωματικής αστάθειας στα καρκινικά κύτταρα. Η γονιδιωματική αστάθεια είναι υψίστης σημασίας για την ανάπτυξη του CRC, την εξέλιξή του και την αντίσταση στη θεραπεία. Υπάρχουν δύο τουλάχιστον ξεχωριστά μονοπάτια που οδηγούν σε γονιδιωματική αστάθεια στον καρκίνο του παχέος εντέρου του ανθρώπου: η χρωμοσωμική αστάθεια (CIN) και η μικροδορυφορική αστάθεια (MSI). Η πλειονότητα των περιπτώσεων καρκίνου παχέος εντέρου του ανθρώπου προκύπτουν μέσω της χρωμοσωμικής αστάθειας, που χαρακτηρίζεται από ανευπλοειδία. Γενικά, θεωρείται ότι η χρωμοσωμική αστάθεια προκύπτει από λάθη κατά το διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων και απομόνωσή τους, λόγω ελαττωμάτων στα κεντροσώματα, στο σχηματισμό της μιτωτικής ατράκτου ή/και των σημείων ελέγχου της μίτωσης. Το αντιγραφικό στρες δημιουργεί, επίσης, αριθμητικές και δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Ωστόσο οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην χρωμοσωμική αστάθεια στον καρκίνο του παχέος εντέρου δεν είναι γνωστοί. Η Integrin-linked kinase (ILK), μία ευρέως εκφραζόμενη πρωτεϊνική κινάση σερίνης/θρεονίνης, που εδράζεται στις εστιακές συνδέσεις, παίζει κυρίαρχο ρόλο ως πολυλειτουργικός παράγοντας σηματοδότησης αυξητικών παραγόντων και αλληλεπιδράσεων με την εξωκυττάρια ουσία. Η ILK αποτελεί κομβικό σημείο στην σηματοδότηση από την εξωκυττάρια ουσία μέσω ιντεγκρινών και αυξητικών παραγόντων και ρυθμίζει σημαντικές λειτουργίες όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η επιβίωση, η κυτταρική μετανάστευση, η διήθηση και μετάσταση. Μέσω του συμπλέγματος πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων και της ρυθμιζόμενης δραστικότητας ως κινάσης, έχει αποδειχθεί ότι η ILK ελέγχει θεμελιώδεις διαδικασίες του κυττάρου, όπως είναι ο πολλαπλασιασμός, η επιβίωση, η μετανάστευση, η διήθηση και η επιθηλιομεσεγχυματική μετάβαση. Η ILK έχει ογκογόνο δράση στον άνθρωπο και αντιπροσωπεύει έναν νέο αντικαρκινικό θεραπευτικό στόχο. Προγενέστερες μελέτες έχουν δείξει ότι η υπερέκφραση της ILK συσχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου στον καρκίνο του παχέος εντέρου του ανθρώπου. Η ενεργοποίηση των οδών β-κατενίνης και Akt, καθώς και η EMT πιθανώς μεσολαβεί στις λειτουργίες της ILK στην εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. Εκτός από τη λειτουργία της ILK ως ικριώματος και πρωτεϊνικής κινάσης στις συνδέσεις εστιακής προσκόλλησης, η ILK φαίνεται επίσης, να εντοπίζεται στα κεντροσώματα και να ρυθμίζει τη δυναμική των μικροσωληνίσκων και την οργάνωση της μιτωτικής ατράκτου, αυξάνοντας την πιθανότητα σχηματισμού ελαττωματικών μιτωτικών ατράκτων κατά την υπερέκφραση της ILK, που μπορεί να οδηγήσουν σε γονιδιωματική αστάθεια στον καρκίνο του παχέος εντέρου στον άνθρωπο. Ωστόσο, η εμπλοκή της υπερέκφρασης της ILK στους μηχανισμούς της γονιδιωματικής αστάθειας στον καρκίνο του παχέος εντέρου δεν έχει μέχρι τώρα διευκρινιστεί. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η αξιολόγηση του ρόλου της ILK σε μηχανισμούς γονιδιωματικής αστάθειας στον καρκίνου του παχέος εντέρου στον άνθρωπο. Υλικό και μέθοδοι Αξιολογήσαμε τη συσχέτιση της έκφρασης της ILK με δείκτες γονιδιωματικής αστάθειας σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα και ιστικά δείγματα. Η έκφραση της ILK σε 79 δείγματα καρκινικών ιστών παχέος εντέρου αξιολογήθηκε με τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Δείκτες γονιδιωματικής αστάθειας, όπως σχηματισμός μικροπυρήνων, μέγεθος και ένταση φθορισμού του πυρήνα, διερευνήθηκαν σε διπλοειδή καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου παχέος εντέρου HCT 116 κατά την υπερέκφραση της ILK (παροδική διαμόλυνση) με ανοσοφθορισμό και σε δείγματα ασθενών με καρκίνο παχέος εντέρου με ιστοχημική χρώση Feulgen. Μελετήσαμε επίσης, το ρόλο της ILK στα κεντροσώματα και στο σχηματισμό των μιτωτικών ατράκτων. Ο αριθμός, η δομή των κεντροσωμάτων και η μορφολογία της μιτωτικής ατράκτου κατά την υπερέκφραση της ILK και τη φαρμακευτική αναστολή της σε κυτταρικές σειρές καρκίνου παχέος εντέρου διερευνήθηκε με ανοσοφθορισμό, χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για κεντροσώματα και μιτωτικούς άξονες, όπως η γ-tubulin και η α-tubulin αντίστοιχα. Αξιολογήσαμε επίσης, τη συσχέτιση της υπερέκφρασης της ILK με δείκτες βλάβης στο DNA (p-H2AX, p-ATM-ATR) σε δείγματα καρκινικά δείγματα ιστού ασθενών με καρκίνο παχέος εντέρου, με τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας, καθώς και σε κύτταρα που υπερεκφράζουν την ILK με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού. Προκειμένου να προσδιοριστεί εάν η υπερέκφραση της ILK οδηγεί σε απόπτωση, εξετάσαμε την έκφραση της κασπάσης-3 με ανοσοφθορισμό σε κύτταρα που υπερεκφράζουν την ILK. Τέλος, εξετάσαμε τη συσχέτιση της έκφρασης της ILK με πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην αδειοδότηση αντιγραφής του DNA, συμπεριλαμβανομένων των Geminin, Cdt-1 και MCM7. Για το σκοπό αυτό, η έκφραση παραγόντων αδειοδότησης διερευνήθηκε με ανοσοϊστοχημεία εν συγκρίσει με την έκφραση της ILK σε ιστικά δείγματα ασθενών με καρκίνο παχέος εντέρου, καθώς και με RT-PCR και ανοσοφθορισμό σε κύτταρα HCT 116 μετά από υπερέκφραση ή αναστολή της δράσης της ILK.Αποτελέσματα Η ILK υπερεκφράζεται στον καρκίνο του παχέος εντέρου και εντοπίζεται στον πυρήνα και στα κεντροσώματα των καρκινικών κυττάρων. Επίσης, η υπερέκφρασή της σχετίζεται με δείκτες γονιδιωματικής αστάθειας, τόσο in vitro, όσο και in vivo σε δείγματα ιστών. Επιπλέον, δείξαμε ότι η ILK εμπλέκεται στη δημιουργία της μιτωτικής ατράκτου, καθώς η φαρμακολογική αναστολή της προκαλεί ανώμαλες μιτωτικές ατράκτους, ενώ τα κύτταρα που υπερεκφράζουν την ILK αποτυγχάνουν να υποστούν μιτωτική σύλληψη επαγόμενη από τη Νοκοδαζόλη. Περεταίρω μελέτη στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά HCT116 ανέδειξε ότι η υπερέκφραση της ILK σχετίζεται με βλάβη στο DNA ή/και αντιγραφικό στρες (replication stress), καθώς παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά στην έκφραση της πρωτεΐνης p-γ-H2AX μεταξύ κυττάρων που υπερεκφράζουν την ILK και των παροδικώς διαμολυσμένων κυττάρων ελέγχου. Είναι αξιοσημείωτο ότι τα κύτταρα που υπερεκφράζουν την ILK φαίνεται να προκαλούν εκτεταμένες βλάβες στο DNA, όπως φαίνεται από τον ανοσοφθορισμό της p-H2AX, δίνοντας την εικόνα του “pan-nuclear damage”. Παρόλες τις βλάβες στο DNA που αναδείχθηκαν, τα κύτταρα που υπερεκφράζουν την ILK δεν οδηγούνται σε απόπτωση. Επιπλέον, τα κύτταρα που υπερεκφράζουν την ILK μειώνουν σημαντικά την έκφραση των δεικτών GMNN και MCM-7 και φαίνεται ότι αυξάνουν, αλλά όχι στατιστικώς σημαντικά, την έκφραση του Cdt-1. Αντιθέτως, η αναστολή της δράσης της ILK φαίνεται να μην επηρεάζει σημαντικά τη μεταβολή της έκφρασης των δεικτών GMNN, MCM-7 και Cdt-1. Συμπεράσματα Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η υπερέκφραση της ILK στο καρκίνο του παχέος εντέρου του ανθρώπου οδηγεί σε βλάβη του DNA και γονιδιωματική αστάθεια. Συγκεκριμένα, δείχνουμε ότι η υπερέκφραση ILK στον καρκίνο παχέος εντέρου του ανθρώπου σχετίζεται με βλάβη του DNA, πιθανότατα σχετιζόμενη με αντιγραφικό στρες, προκαλώντας φαινότυπο γονιδιακής αστάθειας. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν έναν νέο ρόλο της ILK στον καρκίνο του παχέος εντέρου του ανθρώπου.