Διερεύνηση του ρόλου της σηματοδότησης από τις εστιακές συνδέσεις (focal adhesions) στην παθογένεια του καρκίνου του πνεύμονα και του παχέος εντέρου

Abstract

Introduction: Lung and colorectal cancer are among the most common types of cancer worldwide in terms of morbidity and mortality. Despite advances in molecular medicine, it is still imperative to find novel predictive and prognostic markers. KRAS mutations are among the most common genetic alterations in lung and colon cancer with prognostic and therapeutic significance. Focal Adhesions (FAs), connect the cell with the ECM through integrins, regulating critical processes implicated in carcinogenesis, such as invasion and metastasis. Integrin-linked kinase (ILK), a serine-threonine kinase located at focal adhesions regulates important cellular functions such as cell migration, survival and EMT and it has been shown to exert an oncogenic role in cancer. ILK has been shown to be overexpressed in many human malignancies and is frequently associated with reduced survival. ILK forms a complex with PINCH and PARVIN family of proteins at FAs-the IPP complex that is critically implicated in integrin and growth factor signaling. The exact role of IPP proteins in human colon and lung cancer is largely unkown. Recent evidence link ILK to KRAS oncogenic functions in pancreatic cancer, and Ras suppressor-1 (RSU1), originally identified as a suppressor of RAS oncogenic functions, has been recently found to interact with the IPP complex regulating cell migration but its exact role in carcinogenesis is not yet clarified. These findings may prove to have major clinical implications in KRAS-driven cancers such as lung adenocarcinoma (LUADC).Aim: To evaluate the role of focal adhesion signaling and especially IPP and RSU1 proteins in human colon and lung cancer. To this end, the role of focal adhesion signaling (IPP complex, RSU1) was examined in colorectal cancer progression in relation to EMT and resistance to chemotherapy and in lung adenocarcinoma development and progression in relation to prognosis, KRAS signaling and EMT. Materials and Methods: We used immunohistochemistry on human colorectal and aenocarcnoma tissue samples and KRAS-driven LUADC in mice, analysis of large scale publicly available RNA sequencing data, ILK overexpression and pharmacologic inhibition of ILK in human colon and lung cancer cell lines, knockdown of KRAS and RSU1 in lung cancer cells, qPCR and immunofluorescence analysis.Results: 1) ILK expression in human CRC correlates with EMT and is associated with chemoresistance. ILK inhibition increases sensitivity of resistant cells to 5-FU and oxaliplatin and reduces the levels of EMT markers in 5-FU resistant cells 2) ILK, PINCH1 and PARVB proteins are overexpressed in human LUADC and KRAS-driven LUADC in mice and represent poor prognostic indicators in the disease. Silencing of KRAS, as well as, overexpression and pharmacological inhibition of ILK in lung cancer cells provide evidence of a two-way association between ILK and KRAS expression in lung cancer cells. Upregulation of PINCH, PARVB and Ras suppressor-1 (RSU1) expression was demonstrated in ILK overexpressing lung cancer cells in addition to a significant positive correlation between these factors in tissue samples, while silencing of KRAS downregulates IPP proteins and RSU1. Pharmacological inhibition of ILK in KRAS mutant lung cancer cells suppresses cell growth, migration, EMT and also increases sensitivity to platinum-based chemotherapy. 3) RSU1 protein expression was associated with favorable prognosis in lung adenocarcinoma while RSU1 depletion promotes cell migration and EMT in human lung cancer cells. Conclusion: ILK promotes an aggressive cancer phenotype with prognostic and therapeutic value through functions that involve KRAS, IPP and RSU1, as well as EMT, rendering ILK a promising biomarker and therapeutic target in cancer. These results suggest that signaling from focal adhesions, is a promising target for precision medicine and evidence-based therapy in cancer.

Eισαγωγή: Ο καρκίνος του πνεύμονα και του παχέος εντέρου ανήκουν στους συχνότερους τύπους καρκίνου παγκοσμίως σε νοσηρότητα και θνητότητα. Το δεδομένα αυτά παρά την πρόοδο στη μοριακή ιατρική, καθιστούν επιτακτική την ανάγκη ανεύρεσης νέων προβλεπτικών και προγνωστικών βιοδεικτών. Τόσο στον καρκίνο του πνεύμονα όσο και στον καρκίνο του παχέος εντέρου οι μεταλλάξεις του ογκογονιδίου KRAS αποτελούν από τις πιο συχνές γενετικές αλλαγές με σημασία για την πρόγνωση και τη θεραπευτική αντιμετώπιση των ασθενών. Οι εστιακές συνδέσεις (focal adhesions) οι οποίες αποτελούν θέσεις αλληλεπίδρασης κυττάρου-εξωκυττάριας ουσίας μέσω ιντεγκρινών, συμμετέχουν στην επικοινωνία του καρκινικού κυττάρου με το μικροπεριβάλλον και εμπλέκονται σε σημαντικές για την καρκινογένεση διεργασίες όπως η διήθηση και μετάσταση. Η Integrin-linked kinase (ILK), μία κινάση σερίνης/θρεονίνης που αλληλεπιδρά με τις ιντεγκρίνες και εντοπίζεται στις εστιακές συνδέσεις ρυθμίζει σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες όπως η κυτταρική μετανάστευση, η επιβίωση και η Επιθηλιο-Μεσεγχυματική Μετατροπή (ΕΜΤ) και έχει δειχθεί ότι έχει ογκογόνες δράσεις. Η ILK υπερεκφράζεται σε πολλές νεοπλασίες στον άνθρωπο και συχνά σχετίζεται με επιθετική βιολογική συμπεριφορά. Η ILK σχηματίζει με τις πρωτεΐνες PINCH και PARVIN το ετεροτριμερές σύμπλεγμα ILK-PINCH-PARVIN (ΙΡΡ complex) στις εστιακές συνδέσεις το οποίο παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταγωγή σημάτων από τις ιντεγκρίνες και τους αυξητικούς παράγοντες στις εστιακές συνδέσεις. Ο ακριβής ρόλος των πρωτεϊνών του συμπλέγματος ΙΡΡ στον καρκίνο του παχέος εντέρου και του πνεύμονα δεν είναι γνωστός. Ενδιαφέρον είναι ότι πρόσφατα δεδομένα συνδέουν την σηματοδότηση από την ILK με το ογκογονίδιο KRAS στον καρκίνο του παγκρέατος και επιπλέον η πρωτεΐνη καταστολέας του ογκογονιδίου Ras (Ras suppressor-1, RSU1) που αρχικά χαρακτηρίστηκε βασει της ικανότητας της να καταστέλλει τις ογκογόνες δράσεις του ογκογονιδίου Ras αλληλεπιδρά με το ΙΡΡ σύμπλεγμα στις εστιακές συνδέσεις και ρυθμίζει σημαντικές διεργασίες όπως η κυτταρική μετανάστευση. Ο ρόλος της πρωτεΐνης RSU1 στην καρκινογένεση δεν έχει διαλευκανθεί. Τα δεδομένα αυτά καθιστούν τις πρωτεΐνες του συμπλέγματος ΙΡΡ πολλά υποσχόμενους βιοδείκτες και θεραπευτικούς στόχους στους KRAS μεταλλαγμένους όγκους. Σκοπός: Να διερευνησούμε το ρόλο της σηματοδότησης από τις εστιακές συνδέσεις και ειδικότερα το ρόλο των πρωτεϊνών του συμπλέγματος ΙΡΡ και της πρωτεΐνης RSU1 στον καρκίνο του παχέος εντέρου και του πνεύμονα. Για τον σκοπό αυτό, αρχικά μελετήθηκε ο ρόλος της σηματοδότησης από τις εστιακές συνδέσεις (ΙPP, RSU1) στην εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου σε σχέση με την ΕΜΤ και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία και στην συνέχεια μελετήθηκε η συμμετοχή των πρωτεϊνών των εστιακών συνδέσεων στους μηχανισμούς ανάπτυξης και εξέλιξης του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα σε σχέση με την πρόγνωση, τη σηματοδότηση από το ογκογονίδιο KRAS και την ΕΜΤ. Υλικά και Μέθοδοι: Η έκφραση των πρωτεϊνών των εστιακών συνδέσεων μελετήθηκε σε ιστικά δείγματα καρκινώματος παχέος εντέρου και αδενοκαρκινώματος πνεύμονα καθώς και σε ιστικά δέιγματα KRAS επαγόμενων όγκων πνεύμονα ποντικών με τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Χρησιμοποιήθηκαν επίσης δημόσια διαθέσιμες βάσεις δεδομένων (RNA seq data) και in vitro πειράματα υπερέκφρασης και φαρμακευτικής αναστολής της ILK σε κυτταρικές σειρές καρκίνου παχέος εντέρου και πνεύμονα, αποσιώπηση KRAS και RSU1 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, qPCR και ανοσοφθορισμός.Αποτελέσματα: 1) H ILK υπερεκφράζεται στον καρκίνο του παχέος εντέρου στον άνθρωπο και σχετίζεται με δείκτες ΕΜΤ και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία. Η φαρμακευτική αναστολή της ILK σε ανθεκτικά σε 5-FU καρκινικά κύτταρα παχέος εντέρου μειώνει την έκφραση δεικτών ΕΜΤ και την αντίσταση στην χημειοθεραπεία. 2) Οι πρωτεΐνες του συμπλέγματος ΙΡΡ υπερεκφράζονται στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα στον άνθρωπο αλλά και σε όγκους πνεύμονα ποντικών σε ζωικό μοντέλο KRAS επαγόμενης καρκινογένεσης. Τα υψηλά επίπεδα ILK αποτελούν ανεξάρτητο δυσμενή προγνωστικό δείκτη 5-ετούς επιβίωσης στον καρκίνο του πνεύμονα. Τα δεδομένα από τα πειράματα αποσιώπησης του KRAS, υπερέκφρασης και φαρμακευτικής αναστολής της ILK υποστηρίζουν μια αμφίδρομη σχέση αλληλεπίδρασης μεταξύ της ILK και του ογκογονιδίου KRAS σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα in vitro. Αυξημένα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών PINCH, PARVB και RSU1 βρέθηκαν σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα που υπερεκφράζουν την ILK ενώ διαπιστώθηκε επίσης θετική σημαντική συσχέτιση μεταξύ αυτών των πρωτεϊνών στα ιστικά δείγματα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα. Η αποσιώπηση του KRAS οδηγεί σε μείωση της έκφρασης των πρωτεϊνών του συμπλέγματος IPP και του RSU1. Η φαρμακευτική αναστολή της ILK σε KRAS μεταλλαγμένα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα μειώνει την κυτταρική μετανάστευση και την ΕΜΤ και αυξάνει την ευαισθησία σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα. 3) Τα υψηλά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης RSU1 στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα σχετίζονται με ευνοϊκή πρόγνωση ενώ η αποσιώπηση RSU1 σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα προάγει την κυτταρική μετανάστευση και την ΕΜΤ υποστηρίζοντας έναν πιθανό ογκοκατασταλτικό ρόλο της πρωτεΐνης στον καρκίνο του πνεύμονα.Συμπεράσματα: H ILK επάγει έναν επιθετικό φαινότυπο στον καρκίνο, μέσω μηχανισμών που εμπλέκουν το ΙΡΡ σύμπλεγμα, την πρωτεΐνη RSU1, το ογκογονίδιο KRAS και την ΕΜΤ. Τα παραπάνω ευρήματα καθιστούν την ΙLK ιδανικό προγνωστικό βιοδείκτη και θεραπευτικό στόχο. Τα αποτελέσματα της μελέτης, υποστηρίζουν οτι η σηματοδότηση από τις εστιακές συνδέσεις και συγκεκριμένα από το μονοπάτι της ILK αποτελεί έναν υποσχόμενο στόχο για την εξατομικευμένη θεραπεία στον καρκίνο στον άνθρωπο.