Περίληψη
Οι μεμβρανικές πρωτεΐνες αποτελούν μία ιδιαιτέρως σημαντική και μεγάλη οικογένεια πρωτεϊνών η οποία εμπλέκεται σε ένα εύρος κυτταρικών λειτουργιών. Στους ευκαρυωτικούς και προκαρυωτικούς οργανισμούς, το 20-30% των γονιδίων κωδικοποιεί για μεμβρανικές πρωτεΐνες, τονίζοντας έτσι τη μεγάλη τους σημασία. Συγκεκριμένα, οι μεμβρανικές πρωτεΐνες εμπλέκονται στη μεταφορά θρεπτικών στοιχείων, την κυτταρική σηματοδότηση και τη διατήρηση της κυτταρικής δομής. Επιπλέον, η σημαντικότητά τους διαφαίνεται από το γεγονός πως ένα μεγάλο ποσοστό μεμβρανικών πρωτεϊνών εμπλέκεται σε σοβαρές ασθένειες όπως η επιληψία, ο διαβήτης, η κυστική ίνωση, ο καρκίνος κ.α. Όπως γίνεται κατανοητό, η γνώση της ακριβούς δομής και λειτουργίας τους, αποτελεί ύψιστη ανάγκη καθώς η εύρυθμη λειτουργία όλων των οργανισμών στηρίζεται κατά ένα πολύ μεγάλο βαθμό στις πρωτεΐνες αυτές. Η δομική και λειτουργική μελέτη τους απαιτεί σημαντικές ποσότητες απομονωμένης διαμεμβρανικής πρωτεΐνης υψηλής ποιότητας. Όμως, η ιδιαιτέρως χαμη ...
Οι μεμβρανικές πρωτεΐνες αποτελούν μία ιδιαιτέρως σημαντική και μεγάλη οικογένεια πρωτεϊνών η οποία εμπλέκεται σε ένα εύρος κυτταρικών λειτουργιών. Στους ευκαρυωτικούς και προκαρυωτικούς οργανισμούς, το 20-30% των γονιδίων κωδικοποιεί για μεμβρανικές πρωτεΐνες, τονίζοντας έτσι τη μεγάλη τους σημασία. Συγκεκριμένα, οι μεμβρανικές πρωτεΐνες εμπλέκονται στη μεταφορά θρεπτικών στοιχείων, την κυτταρική σηματοδότηση και τη διατήρηση της κυτταρικής δομής. Επιπλέον, η σημαντικότητά τους διαφαίνεται από το γεγονός πως ένα μεγάλο ποσοστό μεμβρανικών πρωτεϊνών εμπλέκεται σε σοβαρές ασθένειες όπως η επιληψία, ο διαβήτης, η κυστική ίνωση, ο καρκίνος κ.α. Όπως γίνεται κατανοητό, η γνώση της ακριβούς δομής και λειτουργίας τους, αποτελεί ύψιστη ανάγκη καθώς η εύρυθμη λειτουργία όλων των οργανισμών στηρίζεται κατά ένα πολύ μεγάλο βαθμό στις πρωτεΐνες αυτές. Η δομική και λειτουργική μελέτη τους απαιτεί σημαντικές ποσότητες απομονωμένης διαμεμβρανικής πρωτεΐνης υψηλής ποιότητας. Όμως, η ιδιαιτέρως χαμηλή συγκέντρωσή τους στους ενδογενείς ιστούς όπου και εδράζονται, καθιστά ιδιαιτέρως δύσκολη την απομόνωσή τους σε μεγάλες ποσότητες. Συνεπώς, η απόκτησή τους προϋποθέτει την παραγωγή τους σε ετερόλογους οργανισμούς, όπως είναι τα βακτήρια, η ζύμη, τα κύτταρα εντόμων, τα κύτταρα θηλαστικών, καθώς και τα διαγονιδιακά ζώα. Ο οργανισμός Escherichia coli χρησιμοποιείται ευρέως για την παραγωγή διαμεμβρανικών πρωτεϊνών με επιτυχία. Περίπου το 20% των κατατεθειμένων γνωστών δομών στη βάση δεδομένων πρωτεϊνικών δομών (PDB) προέρχεται από παραγωγή τους στον συγκεκριμένο οργανισμό. Παρά την ύπαρξη όμως επιτυχημένων περιπτώσεων, η χρήση του E. coli παραμένει μία πρόκληση καθώς η προσπάθεια παραγωγής διαμεμβρανικών πρωτεϊνών, τις περισσότερες φορές, οδηγεί σε υψηλά επίπεδα σοβαρής κυτταροτοξικότητας και σε πολύ χαμηλά επίπεδα παραγόμενης πρωτεΐνης. Έχοντας ως στόχο την ανάπτυξη E. coli στελεχών με την ικανότητα να αντιμετωπίζουν τις προκλήσεις της ετερόλογης παραγωγής διαμεμβρανικών πρωτεϊνών, το εργαστήριό μας έχει κατασκευάσει δύο τροποποιημένα στελέχη, ονόματι E. coli SuptoxD και SuptoxR, τα οποία μπορούν και ανθίστανται στην υψηλή τοξικότητα που επιφέρει συχνά η παραγωγή των πρωτεϊνών αυτών και, ταυτοχρόνως, παράγουν αυξημένες ποσότητες, τόσο προκαρυωτικών όσο και ευκαρυωτικών, σωστά αναδιπλωμένων διαμεμβρανικών πρωτεϊνών, μέσω της υπερεκφράσεως δύο μεμονωμένων γονιδίων του E. coli: του γονιδίου djlA, και του γονιδίου rraA, αντιστοίχως. Προκειμένου να βελτιστοποιηθούν τα βακτηριακά αυτά στελέχη, προβήκαμε στην εύρεση των κατάλληλων συνθηκών υπερέκφρασης των γονιδίων djlA και rraA, καθώς και των πλέον αποτελεσματικών καλλιεργητικών συνθηκών παραγωγής, οι οποίες θα βελτιστοποιούσαν την ήδη αυξημένη παραγωγή, σωστά ενσωματωμένων και αναδιπλωμένων, διαμεμβρανικών πρωτεϊνών. Μετά την εύρεση των συνθηκών αυτών, οι οποίες οδήγησαν την ετερόλογη παραγωγή διαμεμβρανικών πρωτεϊνών στο βέλτιστο βαθμό, όχι μόνο σε επίπεδο πρωτεϊνικής ποσότητας, αλλά και ποιότητας, ακολούθησε πρωτεϊνική απομόνωση μέσω της οποίας διεπιστώθη πως οι εξεταζόμενες πρωτεΐνες, παρήχθησαν σε πολύ υψηλές ποσότητες (της τάξεως των μιλιγραμμαρίων (mg)) ποσότητα η οποία ικανοποιεί τις απαιτήσεις για περαιτέρω μελέτες. Επιπλέον, η χρήση των βελτιστοποιημένων στελεχών SuptoxD και SuptoxR οδήγησε στην επιτυχή παραγωγή αυξημένων επιπέδων βιολογικώς ενεργής πρωτεΐνης, και συνεπώς κατάλληλης για λειτουργικές μελέτες. Εν συνεχεία, διερευνήσαμε αν φυσικά απαντώμενες, ομόλογες πρωτεΐνες της E. coli DjlA, μπορούν να έχουν παρόμοιες ευεργετικές ιδιότητες με το στέλεχος SuptoxD (E. coli DjlA) και, επιπροσθέτως, αν κάποια εξ αυτών δρα ακόμα πιο αποτελεσματικά στην αντιμετώπιση της επαγόμενης κυτταροτοξικότητας, και στην παραγωγή ακόμα πιο αυξημένης ποσότητας διαμεμβρανικών πρωτεϊνών, συγκριτικά με το στέλεχος 1ης γενιάς SuptoxD. Έχοντας αναζητήσει και βρει ομόλογες, της E. coli DjlA, πρωτεΐνες οι οποίες παρουσίαζαν χαμηλά, μεσαία και υψηλά επίπεδα ομοιότητας με αυτή, ακολούθησε συγκριτική μελέτη τους. Καθώς διαπιστώθηκε πως η πλειοψηφία των DjlA πρωτεϊνών διακρίνονταν από την ικανότητα να αντιμετωπίζουν την επαγόμενη κυτταροτοξικότητα, και κάποιες εξ αυτών να ξεχωρίζουν για την επιτυχή παραγωγή σωστά ενσωματωμένων διαμεμβρανικών πρωτεϊνών σε αυξημένες ποσότητες, επιλέχθηκε η πρωτεΐνη DjlA που προερχόταν από τον οργανισμό Salmonella enterica, η οποία ξεπερνούσε τις ήδη υψηλές αποδόσεις της E. coli DjlA. Χρησιμοποιώντας την πρωτεΐνη αυτή, δημιουργήθηκε το στέλεχος 2ης γενιάς, SuptoxD2.0. Η χρήση του στελέχους αυτού απέφερε εξαιρετικά υψηλές ποσότητες διαμεμβρανικής ενεργής πρωτεΐνης, υψηλής ποιότητας, σε αναδιπλωμένη και μη συσσωματωμένη μορφή, καθιστώντας το ως ιδανικό σύστημα ετερόλογης παραγωγής διαμεμβρανικών πρωτεϊνών, το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί ευρέως από την κοινότητα της βιοτεχνολογίας.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
Membrane proteins (MPs) constitute a large family of proteins involved in a range of cellular functions. In eukaryotic and prokaryotic organisms, about 20-30% of their genes encode for MPs, pointing out their great importance. Specifically, MPs participate in the transport of nutrients, cellular signaling and the maintenance of cellular structure. Their great importance is reflected by the fact that a wide variety of MPs are involved in numerous devastating human diseases, such as epilepsy, diabetes, cystic fibrosis, hypertension, cancer, and many more. The understanding of MP structure and function is very important as the well-being of an organism greatly relies on them. The structural and functional studies of MPs require substantial quantities of pure and high-quality protein. However, as their natural abundance in their native tissues is really low, significant amounts of isolated protein are typically acquired after recombinant overexpression in heterologous hosts, such as bacter ...
Membrane proteins (MPs) constitute a large family of proteins involved in a range of cellular functions. In eukaryotic and prokaryotic organisms, about 20-30% of their genes encode for MPs, pointing out their great importance. Specifically, MPs participate in the transport of nutrients, cellular signaling and the maintenance of cellular structure. Their great importance is reflected by the fact that a wide variety of MPs are involved in numerous devastating human diseases, such as epilepsy, diabetes, cystic fibrosis, hypertension, cancer, and many more. The understanding of MP structure and function is very important as the well-being of an organism greatly relies on them. The structural and functional studies of MPs require substantial quantities of pure and high-quality protein. However, as their natural abundance in their native tissues is really low, significant amounts of isolated protein are typically acquired after recombinant overexpression in heterologous hosts, such as bacteria, yeasts, inset cells, mammalian cells or transgenic animals. Escherichia coli has been historically used for the production of MPs with great success as ~20% of all MP structures deposited in the Protein Data Bank (PDB) have utilized MP material produced recombinantly in E. coli. Despite these success stories, the use of E. coli remains a challenge as recombinant MP production usually leads to high levels of toxicity for the host and very little membrane- incorporated protein per cell, with a small portion of it in a well-folded and functional form.With the ultimate goal to develop new E. coli strains capable of dealing with the challenges of recombinant MP production, we have recently constructed two engineered strains, called SuptoxD and SuptoxR, which upon co-expression of the effector genes djlA and rraA, respectively, can suppress MP-induced toxicity and they are able to produce enhanced quantities of well-folded recombinant MPs, of both prokaryotic and eukaryotic origin. In this thesis, we systematically looked for gene overexpression and culturing conditions that maximize the accumulation of membrane-integrated and well-folded recombinant MPs in these E. coli SuptoxD and SuptoxR. Having optimized production conditions that lead to enhanced quantities of high-quality recombinant homogeneous MPs, sufficient for functional and structural studies, we proceeded to purification. The purification revealed that tested MPs were produced in high protein quantity (mg), suitable for further studies. Moreover, using the PELDOR technique, we confirmed the correct folding and structural integrity of the protein. Also, we have found that, under optimal conditions, SuptoxD and SuptoxR achieve greatly enhanced recombinant production of functional membrane proteins. Furthermore, we have investigated whether homologous DjlA proteins from other bacteria can also function as suppressors of MP-induced toxicity and as enhancers of recombinant MP production in E. coli similarly to the E. coli DjlA, and also, if we could identify any DjlA variant with better performance, compared to E. coli DjlA. We identified and compared several homologous DjlA proteins with high (>85), intermediate (60-85%) and low (<60%) levels of sequence similarity to the E. coli DjlA of SuptoxD. After finding out that the majority of DjlA variants has beneficial effects by functioning as efficient suppressors of MP-induced toxicity and enhancers of recombinant well-folded MP production in E. coli, we picked the natural DjlA variant of S. enterica. By using this improved-performance DjlA variant from S. enterica, we have constructed the second-generation E. coli strain, called SuptoxD2.0, the use of which enables the production of high-quality and quantity monodisperse recombinant MPs, well-folded, non-aggregated, making this strain an ideal expression host for recombinant membrane protein production, and also a valuable tool for biotechnology field.
περισσότερα