Study of antigenic proteins of the intracellular pathogen Coxiella burnetii, the etiological agent of Q fever

Abstract

Q fever is a prevalent worldwide zoonosis, and has various acute and chronic clinical manifestations. Coxiella burnetii has been identified in a wide range of wild and domestic animals, including arthropods, birds, rodents, carnivores, ungulates and livestock. Acute Q fever is mostly a self-limiting, mild, influenza-like disease, sometimes complicated by severe pneumonia or hepatitis. A proportion of the patients infected by C. burnetii, will progress to persistent focalized Cοχiella burnetii infection after primary infection. Chronic Q fever leads to high death rates if left untreated, which makes early case-finding and preventive measures critical for patients at high risk. Q fever has a high socioeconomic burden that presents significant challenges for both public and animal health. During the past 25 years, 32 outbreaks in Europe have been identified, indicating that the number of Q fever cases is constantly increasing. Q fever has become a serious public health problem in many areas not previously known as endemic zones and represents a major health risk for humans and animals. The economic and public health importance of the disease was recently underscored following the largest ever reported outbreak, which occurred from 2007 up to 2011 in the Netherlands. Concerning the timely diagnosis of chronic Q fever, a diagnostic problem exists since the current gold standard method for the diagnosis, immunofluorescence, has several disadvantages, such as the difference in sensitivity and specificity among commercial diagnostic kits, the objectivity of the interpretation of the results, potential antibody cross-reactions, etc. In the present study we searched several proteins from C. burnetii for their ability to differential diagnose acute or chronic Q fever in human blood serum. As a first step, 16 different proteins were chosen, according to literature for their antigenic properties. In addition, three proteins from Coxiella’s Type IV secretion system (IcmG, IcmK and DotC) were chosen in order to be tested, since this nanomachine is important for the infection and pathogensis of Coxiella. By employing DNA cloning techniques, construction of different plasmids took place. Afterwards, proteins expression was tested in different conditions (culture temperature, IPTG concentration, time of culture after induction). When the proteins of interest were best expressed, they were isolated and purified. The proteins were then used for the screening of sera from patients suffering from chronic Q fever endocarditis, patients whose samples were negative for phase I IgG, patients whose at least one sample was positive for phase I IgG and patients suffering from any kind of rheumatoid disease. Blood donors were used as the control group. Statistics were used to calculate sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value and Cohen’s kappa coefficient (κ) and logistic regression binary analysis was also performed in order to find any possible combinations of proteins that could act as better diagnostic factors.

Ο πυρετός Q είναι μια διαδεδομένη ζωονόσος παγκοσμίως και έχει διάφορες οξείες και χρόνιες κλινικές εκδηλώσεις. Η Coxiella burnetii έχει εντοπιστεί σε ένα ευρύ φάσμα άγριων και κατοικίδιων ζώων, συμπεριλαμβανομένων αρθρόποδων, πτηνών, τρωκτικών, σαρκοφάγων και οπληφόρων ζώων. Ο οξύς πυρετός Q είναι ως επί το πλείστον μια αυτοπεριοριζόμενη, ήπια, παρόμοια με τη γρίπη νόσο, η οποία μερικές φορές περιπλέκεται από σοβαρή πνευμονία ή ηπατίτιδα. Ένα ποσοστό των ασθενών που έχουν μολυνθεί από C. burnetii, θα εξελιχθεί σε επίμονη εστιακή λοίμωξη μετά από την πρωτογενή λοίμωξη. Ο χρόνιος πυρετός Q οδηγεί σε υψηλά ποσοστά θανάτου εάν δεν αντιμετωπιστεί, γεγονός που καθιστά την έγκαιρη εύρεση κρουσμάτων και τα προληπτικά μέτρα κρίσιμα για ασθενείς υψηλού κινδύνου. Ο πυρετός Q έχει υψηλό κοινωνικοοικονομικό βάρος που παρουσιάζει σημαντικές προκλήσεις τόσο για τη δημόσια υγεία όσο και για την υγεία των ζώων. Κατά τα τελευταία 25 χρόνια, έχουν εντοπιστεί 32 επιδημίες πυρετού Q στην Ευρώπη, γεγονός που δείχνει ότι ο αριθμός των κρουσμάτων της νόσου αυξάνεται συνεχώς. Ο πυρετός Q έχει γίνει ένα σοβαρό πρόβλημα δημόσιας υγείας σε πολλές περιοχές που δεν ήταν προηγουμένως γνωστές ως ενδημικές ζώνες και αντιπροσωπεύει σημαντικό κίνδυνο για την υγεία των ανθρώπων και των ζώων. Η σημασία της οικονομικής και δημόσιας υγείας της νόσου υπογραμμίστηκε πρόσφατα μετά τη μεγαλύτερη επιδημία που έχει αναφερθεί ποτέ, η οποία εμφανίστηκε από το 2007 έως το 2010 στην Ολλανδία.Όσον αφορά την έγκαιρη διάγνωση του χρόνιου πυρετού Q, υπάρχει ένα διαγνωστικό πρόβλημα, δεδομένου ότι η τρέχουσα αποδεκτή μέθοδος για τη διάγνωση, ο ανοσοφθορισμός, έχει πολλά μειονεκτήματα. Κάποια από αυτά είναι η διαφορά ευαισθησίας και εξειδίκευσης μεταξύ εμπορικών διαγνωστικών συσκευών, η αντικειμενικότητα της ερμηνείας των αποτελεσμάτων, πιθανές διασταυρούμενες αντιδράσεις αντισωμάτων κ.λπ. Στην παρούσα μελέτη αναζητήσαμε αρκετές πρωτεΐνες από την C. burnetii για την ικανότητά τους να διαφοροποιούν τη διάγνωση οξέος ή χρόνιου πυρετού Q στον ορό του ανθρώπινου αίματος. Ως πρώτο βήμα, επιλέχθηκαν 16 διαφορετικές πρωτεΐνες, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία με βάση τις αντιγονικές τους ιδιότητες. Επιπλέον, τρεις πρωτεΐνες από το σύστημα έκκρισης τύπου IV Coxiella (IcmG, IcmK και DotC) επιλέχθηκαν για να ελεγχθούν, καθώς αυτή η νανομηχανή είναι σημαντική για τη μόλυνση και την παθογένεση του Coxiella. Χρησιμοποιώντας τεχνικές κλωνοποίησης DNA, πραγματοποιήθηκε κατασκευή διαφορετικών πλασμιδίων. Στη συνέχεια, η έκφραση πρωτεϊνών δοκιμάστηκε σε διαφορετικές συνθήκες (θερμοκρασία καλλιέργειας, συγκέντρωση IPTG, χρόνος καλλιέργειας μετά την επαγωγή). Όταν οι πρωτεΐνες ενδιαφέροντος εκφράστηκαν καλύτερα, απομονώθηκαν και καθαρίστηκαν. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για την εξέταση ορών από ασθενείς που πάσχουν από ενδοκαρδίτιδα χρόνιου πυρετού Q, ασθενείς των οποίων τα δείγματα ήταν αρνητικά για IgG φάσης Ι, ασθενείς των οποίων τουλάχιστον ένα δείγμα ήταν θετικό για IgG φάσης I και ασθενείς που πάσχουν από οποιοδήποτε είδος ρευματοειδούς νόσου . Οι αιμοδότες χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα ελέγχου. Χρησιμοποιήθηκαν στατιστικά στοιχεία για τον υπολογισμό της ευαισθησίας, της ειδικότητας, της θετικής προγνωστικής τιμής, της αρνητικής προγνωστικής τιμής και του συντελεστή kappa Cohen (κ) και πραγματοποιήθηκε επίσης δυαδική ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης προκειμένου να βρεθούν τυχόν πιθανοί συνδυασμοί πρωτεϊνών που θα μπορούσαν να λειτουργήσουν ως καλύτεροι διαγνωστικοί παράγοντες.