Μελέτη του εκκριτικού συστήματος του φορέα του πυρετού Q Coxiella burnetii και της απόκρισης του κυττάρου ξενιστή

Abstract

The intracellular pathogen Coxiella burnetii responsible for Q fever is a zoonosis with global distribution (but new Zeeland and Antarctica). C. burnetii is maintained in nature through complex cycles with host organisms (wild and domestic mammals, birds, arthropods even reptiles). Human is an occasional host. Sheep, goats and cattle are the main source of transmission especially during parturition. Infected animals are usually asymptomatic although miscarriages may occur. Bacteria are excreted in the urine, feces and milk but mostly in birth products. Aerosol is the main way of transmission either through excretions of infected animals or via the environment.Two forms of Q fever are reported; acute and chronic form with different symptoms. Common manifestation of acute Q fever is fever with no clear infection (incubation period 2-5 weeks), pneumonia or hepatitis. Acute form of the disease may be asymptomatic. Classic manifestation of Q fever is atypical pneumonia and hepatitis. Hepatitis appears as fever with granulomas development in liver biopsy, viral hepatitis with hepatomegaly but rarely jaundice and hepatitis with no symptoms but fever with increase in serum aminotranserase levels. Due to these heterogeneous symptoms, diagnosis usually delays from 1-14 months. Chronic infection from Coxiella burnetii is the persistent infection for more than 6 months and manifests several months or years after the first infection. Usually (75%), it appears as bacterial endocarditis. Mitral valve and aortic valve are usually affected. Preexisting valve damages, vascular abnormalities (aneurysm, implants) and possible immunosuppression are the main predisposing factors. Moreover, chronic form may appear as aneurysm or implant infection, arthritis, osteomyelitis, chronic hepatitis with fibrosis development, lung fibrosis, lung pseudo-tumor, mixed cryoglobulinemia and chronic fatigue syndrome. Based on structure, the pathogen has two different forms; small cell variants (SCVs) and large cell variants (LCVs). SCVs are the metabolically inactive form of the bacterium and smaller in size compared to LCVs which are considered the metabolic active form of the pathogen. Based on the structure of the lipopolysaccharide there are two different phases of the bacterium; phase I and phase II. Phase I is present in nature and is highly infectious whereas phase II is created from phase I in culture cells during several passages. After transmission, Coxiella burnetii targets alveolar macrophages and cell infection begins. Type IVb secretion system, is responsible for effector proteins secreted in host cells’ cytoplasm necessary for survival and intracellular replication inside vacuoles named Coxiella containing vacuoles (CCV). As the infection progresses the CCV gets full of bacteria. In the present study, efforts have been made to isolate the core sub complex of the type IVsecretion system but also the three subunits IcmG, IcmK and IcmE separately. Another target was studying the response of the host cell when infected with the pathogen in different time points (1, 3 and 10 days post infection) and if or how the proteome of the host cell is differentiated. Also, the morphology of the eukaryotic cell at the corresponding time points by electron microscopy is observed

Το ενδοκυττάριο βακτήριο Coxiella burnetii είναι υπεύθυνο για τον πυρετό Q, μια ζωονόσος με παγκόσμια εξάπλωση (εξαίρεση Νέα Ζηλανδία και Ανταρκτική). Η C. burnetii διατηρείται στη φύση μέσα από πολύπλοκους κύκλους, στους οποίους εμπλέκεται ένα ευρύ φάσμα φυσικών ξενιστών (άγρια και οικόσιτα θηλαστικά, πτηνά, αρθρόποδα ακόμα και ερπετά). Ο άνθρωπος είναι περιστασιακός ξενιστής. Στη μετάδοση κυρίαρχο ρόλο διαδραματίζουν τα παραγωγικά ζώα (βοοειδή, αίγες και πρόβατα), ιδιαίτερα κατά τη διάρκεια του τοκετού. Τα μολυσμένα ζώα συνήθως είναι ασυμπτωματικά, αλλά πιθανόν να συμβούν αποβολές. Τα βακτήρια αποβάλλονται στο περιβάλλον από τις εκκρίσεις των μολυσμένων ζώων (ούρα, κόπρανα, γάλα) κυρίως όμως από τα προϊόντα του τοκετού/ λοχείας. Η αερογενής οδός είναι ο κύριος τρόπος μετάδοσης (εισπνοή μολυσμένων αεροσταγονιδίων είτε απευθείας από τις εκκρίσεις μολυσμένων ζώων ή δευτερογενώς από το περιβάλλον). Ο πυρετός Q απαντάται σε δύο μορφές την οξεία και τη χρόνια με διαφορετικά συμπτώματα. Οι συνηθέστερες εκδηλώσεις του οξέος πυρετού-Q (χρόνος επώασης: 2-5 εβδομάδες) είναι ο πυρετός χωρίς σαφή εστία λοίμωξης (γριπώδης συνδρομή), η πνευμονία ή η ηπατίτιδα Η οξεία μορφή της νόσου πιθανόν να είναι ασυμπτωματική. Κλασική εκδήλωση του πυρετού Q αποτελεί η άτυπη πνευμονία με ή χωρίς συνοδό πλευριτική συλλογή, ενώ συχνότερη εκδήλωση θεωρείται η ηπατίτιδα, που μπορεί να λάβει χαρακτήρες: i) πυρετού αγνώστου αιτιολογίας με συνοδό ανάπτυξη κοκκιωμάτων στη βιοψία ήπατος, ii) ιογενούς ηπατίτιδας με ηπατομεγαλία αλλά σπάνια ίκτερο, iii) ασυμπτωματικής πλην του πυρετού αύξησης των αμινοτρανσφερασών στον ορό. Λόγω της μεγάλης ετερογένειας των συμπτωμάτων, η διάγνωση συνήθως καθυστερεί από 1 ως 14 μήνες.Η χρόνια λοίμωξη από την Coxiella burnetii ορίζεται ως η παραμονή της λοίμωξης περισσότερο από 6 μήνες και εκδηλώνεται πολλούς μήνες ή έτη μετά την πρωτολοίμωξη. Συχνότερα (μέχρι 75%), παρουσιάζεται ως βακτηριακή ενδοκαρδίτιδα με αρνητικές καλλιέργειες. Προσβάλλονται συνήθως η μιτροειδής και η αορτική βαλβίδα. Προϋπάρχουσες βαλβιδικές βλάβες, αγγειακές ανωμαλίες (ανευρύσματα, μοσχεύματα) και ενδεχόμενη ανοσοκαταστολή είναι οι κύριοι προδιαθεσικοί παράγοντες. Επιπλέον, η χρόνια μορφή μπορεί να εμφανίζεται ως λοίμωξη προϋπάρχοντος αορτικού ανευρύσματος ή μοσχεύματος, αρθρίτιδα, οστεομυελίτιδα, χρόνια ηπατίτιδα με ανάπτυξη ίνωσης και κίρρωσης, πνευμονική ίνωση, ψευδο-όγκος του πνεύμονα, μικτή κρυοσφαιριναιμία και σύνδρομο χρόνιας κόπωσης.Το βακτήριο απαντάται σε δύο μορφές ανάλογα με τη δομή του, τα small cell variants (SCVs) large cell variants (LCVs). Η πρώτη είναι η μεταβολικά ανενεργή μορφή του βακτηρίου και μικρότερη σε μέγεθος σε σχέση με τα LCVs όπου θεωρείται η μεταβολικά ενεργή μορφή του βακτηρίου. Επίσης, ανάλογα με τη δομή του λιποπολυσακχαρίτη το βακτήριο χωρίζεται σε δύο φάσεις, φάση Ι και φάση ΙΙ. Η φάση Ι απαντάται στη φύση και αποτελεί τη μολυσματική φάση του βακτηρίου ενώ η φάση ΙΙ δημιουργείται από τη φάση Ι έπειτα από μία σειρά περασμάτων σε κύτταρα. Μετά την εισαγωγή του βακτηρίου στο κύτταρο ξενιστή ξεκινά ο κύκλος μόλυνσης. Με τη βοήθεια του εκκριτικού συστήματος τύπου IVb το βακτήριο εκκρίνει πρωτεΐνες στο κύτταρο ξενιστή που είναι απαραίτητες για την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό του μέσα σε κυστίδια που ονομάζονται Coxiella containing vacuoles (CCV). Όσο προχωρά η μόλυνση το κυστίδιο γεμίζει με βακτήρια Στη παρούσα μελέτη έγιναν προσπάθειες απομόνωσης του υποσυμπλόκου του πυρήνα του εκκριτικού συστήματος αλλά και των τριών υπομονάδων του χωριστά IcmG, IcmK και IcmE. Ένας ακόμη στόχος ήταν η μελέτη της απόκρισης του κυττάρου ξενιστή στην μόλυνση με το παθογόνο σε διαφορετικές χρονικές στιγμές ( 1, 3 και 10 μέρες μετά τη μόλυνση) και πως διαφοροποιείται το πρωτέομα του. Επίσης, να παρατηρηθεί η μορφολογία του ευκαρυωτικού κυττάρου στις αντίστοιχες χρονικές στιγμές με ηλεκτρονική μικροσκοπία