Φαρμακολογική αξιολόγηση και ανάπτυξη συστημάτων χορήγησης μορίων miRNA/siRNA για τη θεραπεία του καρκίνου

Abstract

Despite the advances and extensive research on novel approaches for cancer therapeutics, confronting cancer still remains a challenge in the fields of biomedical/molecular research, molecular pharmacology and drug delivery. In that context, natural systems and endogenous delivery sources, like exosomes, seem to denote valuable tools in cancer therapeutics. Nowadays, exosomes have emerged as novel drug and gene delivery tools owing to their multiple advantages over conventional delivery systems. Exosomes as mimics of “nature’s delivery systems” allow for the delivery of biological molecules such as therapeutic recombinant proteins and nucleic acids which constitute some of the newer drug candidates, to various target tissues, as the former are non-immunogenic in nature due to similar composition as body's own cells. Exosomes are also promising vehicles for the delivery of microRNAs (miRNAs) and small interfering RNAs (siRNAs). Within these frames, in the present work, we have focused on: i) the development of exosome-based delivery systems, derived from cells growing in culture, as well as the physicochemical and molecular characterization of these delivery platforms, and ii) the pharmacological evaluation of exosomes as therapeutic biomolecule carriers in the context of cancer therapeutics. More specifically, the first objective of this project was the isolation of exosomes utilizing stable cell lines growing in culture followed by the detailed physicochemical characterization and the molecular profiling of the derived vesicles. To this end, we utilized well established physicochemical techniques, widely used for the study of conventional new drug delivery systems, as well as innovative techniques in order to unravel exosome proteome profile and lipid identity. Moreover, we attempted to pharmacologically exploit and further assess exosome capability as innovative small RNA ‘bio-shuttles’, utilizing both normal and cancer cell lines as exosome recipients. The aims of this approach were: i) the elucidation of the main factors that affect the selectivity process upon the uptake of exosomes by various cell lines in culture, ii) the development of ‘ideal’ exosome-based delivery carriers derived from specific donor cell lines that could be potentially used for various pathological tissue sites, iii) the further assessment of exosome loading capability with molecular cargo as well as the examination of any time-dependent effect on cargo encapsulation into exosomes and, finally, iv) the evaluation of exosome capability in delivering molecular cargo intracellularly in a versatile set of cell types. The results confirmed the efficient development of exosomal systems utilizing the cell lines under study, and suggest the potential utility of these exosome vehicles as innovative, efficient and selective delivery systems for small DNA and RNA molecules in the context of therapeutics. Moreover, the results highlighted that exosomes derived from the cell lines under examination, possess the potential to be pharmacologically exploitable as innovative small RNA ‘bio-shuttles’ with various applications as targeted therapeutics and theranostics within the concept of nanomedicine and precision medicine.

Η αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση του καρκίνου εξακολουθεί να αποτελεί μεγάλη πρόκληση, τόσο για το πεδίο της βιοιατρικής/μοριακής έρευνας και φαρμακολογίας, όσο και για το πεδίο ανάπτυξης συστημάτων μεταφοράς φαρμάκων/θεραπευτικών για τη στοχευμένη αποδέσμευσή τους στα καρκινικά κύτταρα και στους ιστούς. Στα πλαίσια αυτά, η εκμετάλλευση φυσικών συστημάτων αλλά και φυσιολογικώς παραγόμενων νανο-μορίων, όπως είναι τα εξωσώματα, εμφανίζεται ως μια ενδιαφέρουσα, εναλλακτική προσέγγιση καθώς τα συστήματα αυτά συνιστούν αξιόλογα φαρμακολογικά εργαλεία στη θεραπευτική και φαίνεται να παρέχουν λύσεις σε μια σειρά από μείζονα προβλήματα τα οποία αποτελούν απόρροια της χρήσης συμβατικών θεραπευτικών προσεγγίσεων. Τα κυστίδια αυτά αποτελούν πολύ καλούς υποψηφίους για τη μεταφορά πρωτεϊνών, miRNAs, siRNAs, φαρμάκων και άλλων μορίων, καθώς εμφανίζουν ιδιαίτερα φυσικοχημικά και μοριακά χαρακτηριστικά και πληθώρα πλεονεκτημάτων ως καινοτόμα συστήματα χορήγησης θεραπευτικών. Με βάση τα παραπάνω δεδομένα, στην παρούσα διατριβή επιχειρήθηκε, αρχικά, η ανάπτυξη, ο ενδελεχής φυσικοχημικός χαρακτηρισμός και η μελέτη της λιπιδικής και μοριακής ταυτότητας των εξωσωμάτων απομονωμένων από κυτταρικές καλλιέργειες, με σκοπό την απόκτηση πολύτιμων πληροφοριών για το προφίλ και τη συμπεριφορά των κυστιδίων. Ειδικότερα, χρησιμοποιήθηκαν εξωσώματα απομονωμένα από φυσιολογικές και καρκινικές κυτταρικές σειρές-δότες, αξιοποιώντας δύο βασικές πειραματικές μεθοδολογίες (διαφορική υπερφυγοκέντρηση και εμπορικά διαθέσιμο πολυμερικό αντιδραστήριο). Για το φυσικοχημικό χαρακτηρισμό των απομονωμένων κυστιδίων αξιοποιήθηκαν τεχνικές: α) αποτύπωσης της κατανομής μεγέθους τους και του φορτίου επιφανείας τους (τεχνική δυναμικής σκέδασης του φωτό), β) οπτικοποίησης της μορφολογίας τους (τεχνικές ηλεκτρονικής μικροσκοπίας), γ) αξιολόγησης της λιπιδικής σύστασης της μεμβράνης των εξωσωμάτων (διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης), δ) μελέτης των αλληλεπιδράσεων των εξωσωμάτων με λιπιδικά μόρια (θερμιδομετρία ισόθερμης τιτλοδότησης και φθορισμομετρία σταθερής κατάστασης) καθώς και, ε) ταυτοποίησης/ανάλυσης του συνόλου των πρωτεϊνών που εντοπίζονται στα κυστίδια αυτά (καθολική ανάλυση του πρωτεϊνώματος) μέσω φασματοσκοπίας μάζας. Ακολούθως, τα παραγόμενα και χαρακτηρισμένα εξωσώματα αξιολογήθηκαν φαρμακολογικώς ως πιθανά, καινοτόμα «οχήματα» για την εκλεκτική μεταφορά πρότυπων μορίων-μαρτύρων ελέγχου σε ένα ευρύ φάσμα φυσιολογικών και καρκινικών κυτταρικών σειρών. Απώτερος σκοπός ήταν: α) η διερεύνηση της κυτταρικής επιδεκτικότητας ως προς τα παραγόμενα εξωσώματα ίδιας ή διαφορετικής προέλευσης με τους κυτταρικούς δέκτες, β) η αποκρυπτογράφηση και η κατανόηση των κύριων παραγόντων που επηρεάζουν τη διαδικασία εκλεκτικής πρόσληψης των εξωσωμάτων από κύτταρα σε καλλιέργεια, γ) η διερεύνηση-αξιολόγηση της διαδικασίας ενκαψακίωσης/εισαγωγής των επιθυμητών βιομορίων στα εξωσώματα αλλά των παραγόντων που επηρεάζουν τη διαδικασία αυτή και, δ) η μελέτη, η αξιολόγηση και η επιλογή των καταλληλότερων κυτταρικών σειρών ως δότες εξωσωμάτων τα οποία θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως «καθολικά» συστήματα μεταφοράς βιομορίων για ποικίλα κύτταρα-δέκτες. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης υποδεικνύουν ότι τα απομονωθέντα εξωσώματα από τις υπό μελέτη κυτταρικές σειρές-δότες σε καλλιέργεια, εμφανίζουν ενδιαφέροντα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά και ένα ιδιαίτερο λιπιδικό και μοριακό προφίλ που τους προσδίδουν πολλά πλεονεκτήματα ώστε να ελεγχθούν και να αξιοποιηθούν περαιτέρω ως φορείς θεραπευτικών μορίων και φαρμάκων. Επιπλέον, η ικανότητά τους να ενσωματώνουν και να μεταφέρουν σε κύτταρα-δέκτες κατάλληλα, εξωγενώς χορηγούμενα σε αυτά, φορτία, όπως το πρότυπο μόριο siRNA (scramble siRNA), το οποίο αξιοποιήθηκε στις συγκεκριμένες πειραματικές διαδικασίες, επιβεβαίωσε το συμπέρασμα πως τα κυστίδια αυτά μπορούν να καθιερωθούν μελλοντικά, ως καινοτόμοι φορείς στο πεδίο της έρευνας και ανάπτυξης νέων, βελτιστοποιημένων και περισσότερο εξειδικευμένων συστημάτων χορήγησης με θεραπευτικές προεκτάσεις.