Μελέτη των μοριακών και βιοχημικών μηχανισμών μεταβολισμού του άνθρακα στα αζωτοδεσμευτικά φυμάτια των ψυχανθών

Abstract

Legumes are cornerstones of sustainable agriculture, as the symbiotic relation they form with soil bacteria, called rhizobia, results in nitrogen fixation (symbiotic nitrogen fixation – SNF). SNF takes place inside new plant organs that are developed for this reason, the legume root nodules. This is an extremely high energy demanding process. Sugars produced in photosynthetic tissues are loaded to phloem and transported to sink tissues covering their energy needs. Sugars cross the plasma membrane of the plant cell via specific transmembrane proteins, the sugar transporters, facilitating the appropriate conditions for nodule metabolism and for being potential sites of SNF regulation. In this study, we have used the model symbiotic system of Medicago truncatula- Sinorhizobium meliloti in order to identify plant genes involved in carbon transport. M. truncatula is an excellent candidate for such studies, due to the available databases regarding the sequencing of the genome, the expression of genes, the active metabolic pathways, as well as the existence of established Tnt1-insertion mutant lines. In silico analysis was conducted for identifying M.truncatula Monosaccharide Transporters (MSTs). In this thesis, we present data concerning the phylogenetic taxonomy of these transporters, their gene structure, their amino acid sequence and a prediction of the topology/secondary structure for the corresponding encoded protein. Furthermore, a large transcriptomic and metabolomic analysis was conducted. Total RNA was extracted from different organs and nodule developmental stages of M. Truncatula. The expression of these genes, analysed by RT-qPCR, is depicted. The metabolite content of the detected MSTs organs, under normal photoperiod and under 24 h and 72 h of continuous darkness that resembles carbon starvation conditions was also investigated. The organ-specific regulation was predominant than that of stress-regulation. However several genes as MtSTP1_1, MtSTP3_2, MtSTP7_1, MtSTP7_4, MtSTP10_1, MtSTP10_2, MtSTP13_1, MtESL6_3, MtESL7, MtINT4_1, MtPMT5_1 and MtTMT3_1 were stress-regulated. We also studied the spatial expression, the subcellular localization, the nitrogenase activity and the functional profile of two nodule-induced or nodule-specifically expressed MSTs, MtSTP13 and MtPMT3_1, as well as their phenotype using Tnt1 mutant plants and their metabolites content, in order to identify their physiological and biochemical role. Many differences were detected between mutants and wild plants in transcriptomic levels, in metabolites content and in nitrogenase activity.

Τα ψυχανθή είναι ο ακρογωνιαίος λίθος της αειφόρου παραγωγής, λόγω της συμβιωτικής σχέσης που αναπτύσσουν με τα βακτήρια του εδάφους, που ονομάζονται ριζόβια, με αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός νέου φυτικού οργάνου που ονομάζεται φυμάτιο. Στα φυμάτια λαμβάνει χώρα η συμβιωτική αζωτοδέσμευση, η οποία αποτελεί μία εξαιρετικά απαιτητική ενεργειακά διαδικασία. Τα σάκχαρα που παράγονται στους φωτοσυνθετικούς ιστούς εισάγονται στα αγγεία του ηθμού και μεταφέρονται στους ιστούς καταβόθρες, ώστε να καλύψουν τις ενεργειακές τους ανάγκες. Η μεταφορά των σακχάρων διαμέσου της κυτταροπλασματικής μεμβράνης του φυτικού κυττάρου, λαμβάνει χώρα μέσω εξειδικευμένων διαμεμβρανικών πρωτεϊνών, τους μεταφορείς σακχάρων. Στη μελέτη αυτή, χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο συμβιωτικού συστήματος Medicago truncatula- Sinorhizobium meliloti, με στόχο να εντοπιστούν και να μελετηθεί ο ρόλος των γονιδίων που κωδικοποιούν για μεταφορείς μονοσακχαριτών στο ψυχανθές M. truncatula. Το M. truncatula χρησιμοποείται ευρύτατα ως φυτικό μοντέλο σε τέτοιες μελέτες, λόγω των διαθέσιμων βάσεων δεδομένων που αφορούν την αλληλουχία του γονιδιώματος, τον Άτλαντα γονιδιακής έκφρασης, καθώς και τις διαθέσιμες Tnt1 μεταλλαγμένες σειρές. Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε μια μεγάλη in silico ανάλυση, ώστε να ταυτοποιηθούν οι μεταφορείς μονοσακχαριτών του M.truncatula [Monosaccharide Sugar Transporters (MSTs)]. Παρουσιάζονται ακόμα δεδομένα που αφορούν τη φυλογενετική τους ταξινόμηση, τη γονιδιακή τους δομή, την αμινοξική τους αλληλουχία, και την πιθανή δευτεροταγή τους δομή. Επιπλέον, για τη μελέτη του βιοχημικού και φυσιολογικού ρόλου των μεταφορέων συνδυάστηκαν αποτελέσματα στοχευμένης μεταγραφομικής και μεταβολομικής ανάλυσης. Ολικό RNA απομονώθηκε από διάφορα όργανα και από φυμάτια σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης του M. Truncatula. Η έκφραση των MST-γονιδίων αναλύθηκε με την τεχνολογία RT-qPCR. Ομοίως και το μεταβολομικό τους περιεχόμενο υπό συνθήκες κανονικής φωτοπεριόδου και υπό συνεχές σκότος 24 h και 72 h, γεγονός το οποίο δημιουργεί συνθήκες έλλειψης άνθρακα. Από τα αποτελέσματα φάνηκε ότι η οργανο-ειδική ρύθμιση κυριάρχησε της ρύθμισης από τις συνθήκες παρατεταμένου σκοταδιού. Παρ' όλ' αυτά βρέθηκαν αρκετά MST-γονίδια, όπως τα: MtSTP1_1, MtSTP3_2, MtSTP7_1, MtSTP7_4, MtSTP10_1, MtSTP10_2, MtSTP13_1, MtESL6_3, MtESL7, MtINT4_1, MtPMT5_1 και MtTMT3_1 στα οποία η έκφρασή τους φαίνεται να επηρεάζεται από τις συνθήκες παρατεταμένου σκοταδιού. Μελετήθηκε επίσης η χωροταξική έκφραση, ο υποκυτταρικός εντοπισμός, η δραστηριότητα της νιτρογενάσης και το λειτουργικό προφίλ δύο ισχυρά επαγόμενων ή εξειδικευμένων στα φυμάτια MST-γονιδίων, των MtSTP13 και MtPMT3_1. Πραγματοποιήθηκε επίσης εκτίμηση των φαινοτυπικών τους χαρακτηριστικών με τη χρήση Tnt1 μεταλλαγμένων σειρών φυτών, καθώς και του μεταβολομικού τους περιεχομένου, ώστε να μελετηθεί ο φυσιολογικός και ο βιολογικός ρόλος των συγκεκριμένων μεταφορέων. Πολλές αλλαγές εντοπίστηκαν μεταξύ των φυτών αγρίου τύπου και αυτών των μεταλλαγμένων σειρών τόσο σε μεταγραφομικό όσο και σε μεταβολομικό επίπεδο, όπως επίσης και στη δραστικότητα της νιτρογενάσης.