Investigation of Yersinia enterocolitica in food and study of virulence genes and antimicrobial resistance

Abstract

Yersiniosis has been one of the most frequently reported zoonosis in EU countries and Yersinia enterocolitica is the most prevalent species isolated from human cases with most common serotypes O:3, O:9 and O:8. Pigs are considered the major reservoir for Yersinia, and pork products are the main source of Y. enterocolitica infection in humans. The objectives of the thesis included the study of the prevalence of pathogenic Y. enterocolitica in pork carcasses and fresh vegetables, the comparison of different isolation methods for the recovery of human pathogenic strains and identification of the isolated strains. A total of 145 carcass surface swabs from pigs at slaughter and 144 fresh vegetable samples were collected during 12 months period and analyzed for the detection of Y. enterocolitica with different isolation methods; direct plating, selective enrichment and cold enrichment. Strains were biotyped according to the modified Wauters’ scheme and serotyping was performed with commercially available O antisera. Antimicrobial susceptibility was tested by the Kirby-Bauer and presence of virulence genes by PCR. Y. enterocolitica was found in 15.9% of the carcass swabs (23/145) and in 2.8% of the vegetable samples (4/144). Of the 145 carcass swabs, 15 (10.3%) were identified as human pathogenic bio-serotype 4/O:3 and 9 (6,2%) as biotype 1A. Of the 144 vegetable samples, only one (0.7%) was identified as bio-serotype 4/O:3 (non-organic lettuce) and three (2,1%) as 1A (two mixed salads and one organic lettuce). A total of 59 strains were isolated and biochemically identified as Y. enterocolitica: 54 from the carcass swabs and 5 from the vegetable samples. Pathogenic Y. enterocolitica bio-serotype 4/O:3 was detected in total 15 carcass swabs (10.3%) using different isolation methods. None of the methods detected all of the 4/O:3 positive samples and none of the samples were detected as positive by all methods. The relative sensitivity of the combination of cold enrichment for 7 days with or without alkali treatment was higher (73.3%) than others isolation procedures. Of the 54 Y. enterocolitica isolates of the carcass swabs, 37 (68.5%) were identified as 4/O:3 and the rest 17 as non-pathogenic biotype 1A (31.5%). The ail, ystA, inv, virF, myfA and foxA genes were detected in all of the 4/O:3 isolates, whereas the yadA in 64.9%. All 4/O:3 isolates were negative for the ystB gene. The most common virulence-associated genes in 1A isolates were the inv (100%), ystB (94.1%) and foxA (84.4%). Of the 4 Y. enterocolitica strains of the vegetable samples which were isolated by cold enrichment for 7 days, only one was identified as 4/O:3 and 3 belonging to biotype 1A/O-untypeable. All isolates were susceptible to cefotaxime, ceftazidime, ceftriaxone, ciprofloxacin, imipenem, tetracycline and ticarcillin/clavulanic acid. On the contrary all isolates were resistant to ampicillin. Resistances to amoxicillin/clavulanic acid (55.2%), cefoxitin (39.7%), cefixime (18.9%) and chloramphenicol (15.5%) were the most common.

Η Υερσινίωση είναι μία από τις συχνότερα αναφερόμενες ζωονόσους στις χώρες της Ευρωπαϊκής Ένωσης (ΕΕ) και η Yersinia enterocolitica το επικρατέστερο είδος που απομονώνεται από κλινικά περιστατικά με συχνότερους οροτύπους τους O:3, O:9 και O:8. Οι χοίροι θεωρούνται φορείς της Yersinia και το χοιρινό κρέας και τα προϊόντα του η κυριότερη πηγή μόλυνσης παθογόνων στελεχών της Y. enterocolitica που προκαλούν λοιμώξεις στον άνθρωπο. Στους σκοπούς της παρούσας διατριβής περιλαμβάνονται η διερεύνηση της παρουσίας Y. enterocolitica σε χοιρινά σφάγια και σε φρέσκα λαχανικά, η αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας των προτεινόμενων διαφόρων μεθόδων απομόνωσης παθογόνων στελεχών της Y. enterocolitica που προκαλούν λοιμώξεις στον άνθρωπο και η ταυτοποίηση των στελεχών. Συλλέχθηκαν 145 επιχρίσματα επιφανείας με χρήση σπόγγου από ισάριθμα χοιρινά σφάγια και 144 δείγματα νωπών λαχανικών στη διάρκεια ενός έτους και εξετάστηκαν μικροβιολογικά για την ανίχνευση Y. enterocolitica με διαφορετικές μεθόδους απομόνωσης: άμεση επίστρωση, εκλεκτικός και ψυχρός εμπλουτισμός. Ο καθορισμός του βιοτύπου των στελεχών έγινε σύμφωνα με το αναθεωρημένο σχήμα των Wauters και συν. και η ορολογική τυποποίηση με εμπορικά διαθέσιμους αντιορούς. Για τον έλεγχο της ευαισθησίας σε αντιμικροβιακές ουσίες χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της διάχυσης σε άγαρ Bauer-Kirby και η παρουσία γονιδίων λοιμογονικότητας μελετήθηκε με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Στελέχη της Y. enterocolitica ανιχνεύθηκαν στο 15.9% των χοιρινών δειγμάτων και στο 2.8% των δειγμάτων λαχανικών. Από τα 145 δείγματα χοιρινών, στα 15 (10.3%) ανιχνεύθηκε ο παθογόνος για τον άνθρωπο βιο-ορότυπος 4/O:3 και στα 9 (6,2%) ο βιότυπος 1A. Από τα 144 δείγματα λαχανικών, μόνο ένα (0.7%) ανιχνεύθηκε θετικό στο βιο-ορότυπο 4/O:3 και σε 3 (2,1%) βρέθηκε ο βιότυπος 1A. Συνολικά απομονώθηκαν 59 στελέχη που ταυτοποιήθηκαν βιοχημικά ως Y. enterocolitica: 54 από τα χοιρινά και 5 από τα δείγματα λαχανικών. Στελέχη του παθογόνου βιο-οροτύπου 4/O:3 ανιχνεύθηκε σε 15 χοιρινά (10.3%) με διαφορετικές μεθόδους απομόνωσης. Η σχετική ευαισθησία του ψυχρού εμπλουτισμού για 7 μέρες με ή χωρίς κατεργασία με αλκάλι ήταν μεγαλύτερη (73.3%) από την αντίστοιχη των άλλων μεθόδων. Από τα 54 στελέχη προερχομένων από τα χοιρινά, 37 (68.5%) ταυτοποιήθηκαν ως 4/O:3 και τα υπόλοιπα 17 ως 1A (31.5%). Τα γονίδια ail, ystA, inv, virF, myfA and foxA ανιχνεύθηκαν σε όλα τα 4/O:3 στελέχη και το yadA γονίδιο σε ποσοστό 64.9%, ενώ σε κανένα δεν ανιχνεύθηκε το γονίδιο ystB. Τα γονίδια που βρέθηκαν να φέρουν τα στελέχη 1A ήταν τα inv (100%), ystB (94.1%), και foxA (84.4%). Από τα 4 στελέχη Y. enterocolitica των λαχανικών τα οποία απομονώθηκαν με τη μέθοδο ψυχρού εμπλουτισμού για 7 μέρες, ένα μόνο ταυτοποιήθηκε ως 4/O:3 και τρία ως 1Α. Όλα τα 58 στελέχη ήταν ευαίσθητα στην κεφοταξίμη, κεφταζιδίμη, κεφτριαξόνη, σιπροφλοξασίνη, ιμιπενένη, τετρακυκλίνη και τικαρσιλλίνη/κλαβουλανικό οξύ. Αντιθέτως, όλα ήταν ανθεκτικά στην αμπικιλλίνη. Τα μεγαλύτερα ποσοστά αντοχής εμφανίστηκαν στο συνδυασμό αμοξυκιλλίνη-κλαβουλανικό οξύ (55.2%), στην κεφοξιτίνη (39.7%), κεφιξίμη (18.9%) και χλωραμφενικόλη (15.5%).