Mitophagy and oxidation status of mitochondria in Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF) macrophages: a study in bronchoalveolar lavage fluid (BALF)

Abstract

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is the most common among the fibrosing interstitial lung diseases and is characterised by progressive deterioration of lung function and poor prognosis. The role of pulmonary macrophages in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis remains controversial and poorly understood; although it is considered that they orchestrate the progression and maintenance of fibrosis. Impaired mitochondria homeostasis and function are established hallmarks of aging and increasing evidence suggests a link with lung fibrosis. Mitochondria homeostasis may be also affected in alveolar macrophages in idiopathic pulmonary fibrosis. In this study, we used bronchoalveolar lavage (BAL), a tool for both clinical and research purposes, and a rich source of alveolar macrophages.In this study, BAL samples were examined from 52 patients with IPF and 19 healthy individuals. Measurements of mitochondria reactive oxygen species (ROS), mitochondria morphology and related gene expression were performed. Additionally, autophagy and mitophagy levels were analysed. Our results showed that mitochondria in alveolar macrophages from IPF patients have prominent morphological defects and impaired transcription. We observed a significant reduction of mitochondria homeostasis regulators PINK1, PARK2 and NRF1. Additionally, a significant increase in mitochondria ROS was associated with reduced expression of mitochondria-encoded oxidative phosphorylation (OXPHOS) genes. However, despite the increase in damaged, oxidised mitochondria, macroautophagy and mitophagy, central processes in the maintenance of healthy mitochondria levels, were not upregulated in IPF AMs. Importantly, mitochondria ROS was correlated with lung function parameters and disease severity as measured by composite physiologic index (CPI). Conclusively, our results suggest a perturbation of mitochondria homeostasis in alveolar macrophages in IPF.

Ανάμεσα στις Διάχυτες Διάμεσες Πνευμονοπάθειες (ΔΔΠ), η Ιδιοπαθής Πνευμονική Ίνωση (ΙΠΙ) αποτελεί την πιο συχνή ιδιοπαθή διάμεση πνευμονοπάθεια και την πιο σοβαρή νόσο λαμβάνοντας υπόψη την προοδευτική επιδείνωση της αναπνευστικής λειτουργίας που σχετίζεται με την ποιότητα ζωής, την πτωχή επιβίωση, και τις περιορισμένες θεραπευτικές επιλογές. Παρόλο που τα τελευταία έτη η ανακάλυψη των παθογενετικών μηχανισμών της νόσου όλο και περισσότερο κεντρίζει το ενδιαφέρον των ερευνητών, τα αίτια παθογένειας της ΙΠΙ παραμένουν εν πολλοίς άγνωστα. Το προτεινόμενο μοντέλο παθογένειας που επικρατεί έως σήμερα αναφέρεται σε βλάβες του επιθηλίου του βρογχικού δέντρου και των κυψελίδων που οφείλονται σε περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως την έκθεση σε καπνό, ιογενείς λοιμώξεις, γαστροοισοφαγική παλινδρόμηση, και όλα αυτά σε ένα υπόβαθρο ενός επιθηλίου γενετικά προδιαθετημένου σε ανώμαλη επιδιόρθωση. Απορρύθμιση των μηχανισμών επούλωσης, ανώμαλη επανα-επιθηλιοποίηση, υπέρμετρος πολλαπλασιασμός ινοβλαστών και μεγάλη παραγωγή εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, αποτελούν τα στοιχεία που χαρακτηρίζουν την παθογένεια της ΙΠΙ. Μηχανισμοί οι οποίοι αποτελούν μονοπάτια της γήρανσης έχουν βρεθεί και στην ΙΠΙ , συμβάλλοντας στην ενίσχυση της άποψης ότι η νόσος αποτελεί μία νόσο πρώιμης γήρανσης. Σ’ αυτούς συμπεριλαμβάνεται το οξειδωτικό στρες, η δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων, η μη αποτελεσματική αυτοφαγία και οι αλλαγές στην εξωκυττάρια ουσία. Η λεπτή ισορροπία μεταξύ αποικοδόμησης και βιογένεσης των μιτοχονδρίων έχει δειχθεί ότι είναι πολύ σημαντική για τη σωστή λειτουργία του κυττάρου. Συσσώρευση κατεστραμμένων πρωτεϊνών και οργανιδίων που οφείλεται σε μη αποτελεσματική αυτοφαγία οδηγεί σε αυξημένο κυτταρικό στρες και κυτταρικό θάνατο και έχει συσχετιστεί με νοσήματα της γήρανσης. Πρόσφατες μελέτες σε επιθηλιακά κύτταρα και ινοβλάστες σε πειραματικά μοντέλα ή/και ασθενείς με ΙΠΙ έδειξαν δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων και μη αποτελεσματική αυτοφαγία των μιτοχονδρίων, δηλαδή μιτοφαγία. Σημαντικό ρόλο φαίνεται να διαδραματίζει το μόριο PINK1 (PTEN-induced kinase 1) που αποτελεί κύριο ρυθμιστή της διαδικασίας της μιτοφαγίας και τα επίπεδά του έχουν βρεθεί μειωμένα στα επιθηλιακά κύτταρα ασθενών με ΙΠΙ. Ο ρόλος των μακροφάγων αποτελεί τελευταία όλο και περισσότερο αντικείμενο έρευνας καθώς πολλά δεδομένα υποστηρίζουν την εμπλοκή των κυψελιδικών μακροφάγων στην ΙΠΙ. Τα κυψελιδικά μακροφάγα δεν αποτελούν μόνο κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος επηρεάζοντας μέσω ανοσολογικών μηχανισμών, αλλά επίσης μέσω παραγωγής κυτταροκινών διαμορφώνουν το κατάλληλο μικροπεριβάλλον και αλληλεπιδρούν με τους υπόλοιπους κυτταρικούς πληθυσμούς στον πνεύμονα προάγοντας την ανάπτυξη της πνευμονικής ίνωσης. Έχει βρεθεί ότι τα μακροφάγα αποκτώντας ένα εναλλακτικά ενεργοποιημένο φαινότυπο, με αντίσταση στην απόπτωση, συμμετέχουν ενεργά στα μονοπάτια της παθογένειας της ίνωσης μέσω παραγωγής μεσολαβητών οι οποίοι σχετίζονται με την επιβίωση των μυοϊνοβλαστών, την ενεργοποίηση των επιθηλιακών κυττάρων και πιθανά στη μετατροπή των τελευταίων σε μεσεγχυματικά. Η δική μας μελέτη είχε ως στόχο την ανάλυση των μακροφάγων από βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα ασθενών με ΙΠΙ, και συγκεκριμένα την εκτίμηση των μιτοχονδρίων τους. Απομόνωση των κυψελιδικών μακροφάγων πραγματοποιήθηκε από το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα το οποίο ελήφθη μέσω της διαδικασίας της βρογχοσκόπησης. Η λήψη του εκπλύματος αποτελεί μία ελάχιστα επεμβατική μέθοδο που οδηγεί σε συλλογή κυττάρων από τις κυψελίδες, που στο μεγαλύτερο ποσοστό τους αφορούν μακροφάγα (>80%). Οι ασθενείς (52 ασθενείς) που συμπεριελήφθησαν στη μελέτη υπεβλήθησαν σε βρογχοσκόπηση στο πλαίσιο διερεύνησης διάχυτης διάμεσης πνευμονοπάθειας (και έπειτα διαπιστώθηκε/επιβεβαιώθηκε ότι πρόκειται για ΙΠΙ) και συγκρίθηκαν με υγιείς μάρτυρες (19 άτομα) οι οποίοι υπεβλήθησαν σε βρογχοσκόπηση στο πλαίσιο διερεύνησης άτυπων μικροοζιδίων ή για αποκλεισμό πνευμονικής νόσου έπειτα από κάποιο επεισόδιο αιμόπτυσης, και με βάση τα αποτελέσματα της βρογχοσκόπησης (επισκόπηση βρογχικού δέντρου, καλλιέργειες, κυτταρολογικές εξετάσεις ) κρίθηκαν υγιείς. Τα κυψελιδικά μακροφάγα των ατόμων που συμπεριελήφθησαν στην παρούσα μελέτη αξιολογήθηκαν με βάση τα επίπεδα οξείδωσης των μιτοχονδρίων χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής, και διαπιστώθηκε ότι τα μακροφάγα ασθενών με ΙΠΙ εμφανίζουν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα οξειδωμένων μιτοχονδρίων. Το αποτέλεσμα αυτό δεν συσχετίζεται με την καπνιστική συνήθεια των ασθενών, ενώ φάνηκε να σχετίζεται με στατιστική σημαντικότητα με τις κλινικές παραμέτρους της νόσου. Μελετήθηκαν ακολούθως τα επίπεδα αυτοφαγίας και μιτοφαγίας ώστε να διερευνηθεί εάν η αύξηση των οξειδωμένων μιτοχονδρίων οφείλεται σε μειωμένη διαδικασία αποικοδόμησης και ανακύκλωσης στα κύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, όμως δεν διαπιστώθηκαν σημαντικές διαφορές ανάμεσα σε ασθενείς και υγιείς μάρτυρες. Επιπλέον, εκτιμήθηκε η μορφολογία των μιτοχονδρίων στα κυψελιδικά μακροφάγα με τη χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου. Παρατηρήθηκε ότι τα μιτοχόνδρια στα μακροφάγα των ασθενών είναι δύσμορφα και έχουν αυξημένη διάμετρο υπονοώντας πιθανή δυσλειτουργία σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες. Παράλληλα, επιβεβαιώθηκε ότι τα μακροφάγα στους ασθενείς με ΙΠΙ παρουσιάζουν δείκτες μάλλον υπέρ εναλλακτικής ενεργοποίησης-προϊνωτικό προφίλ. Τέλος, εκτιμήθηκε η έκφραση διαφόρων γονιδίων που σχετίζονται με την ανακύκλωση και την οξειδωτική φωσφορυλίωση που συμβαίνει στα μιτοχόνδρια, και βρέθηκε διαταραγμένη στους ασθενείς. Η μελέτη αυτή αποτελεί την πρώτη προσπάθεια χαρακτηρισμού της διαδικασίας της αυτοφαγίας, της μορφολογίας, και της οξείδωσης των μιτοχονδρίων στα μακροφάγα ασθενών με ΙΠΙ ρίχνοντας φως σε πιθανά παθογενετικά μονοπάτια της σοβαρής αυτής ασθένειας. Είναι σαφές από τα αποτελέσματα της μελέτης ότι τα μιτοχόνδρια των κυψελιδικών μακροφάγων των ασθενών με ΙΠΙ είναι δύσμορφα και δυσλειτουργικά, με αυξημένα επίπεδα οξείδωσης. Καθώς είναι αδιαμφισβήτητη η σημασία των μακροφάγων , όχι μόνο ως κύτταρα του ανοσοποιητικού, αλλά και ως ενορχηστρωτές της ινωτικής διεργασίας στον πνεύμονα, τα νέα δεδομένα αποτελούν σημαντικά στοιχεία που θα μπορούσαν να βοηθήσουν στον καλύτερο χαρακτηρισμό αυτού του αινιγματικού κυτταρικού πληθυσμού, σχετικά με τη λειτουργία, τη δράση και το μεταβολισμό τους.