Τα miRNAs και γενετικοί πολυμορφισμοί ως νέοι δείκτες διάγνωσης και πρόγνωσης για το οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου

Abstract

Cardiovascular diseases (CVD) are the most common cause of death worldwide. Current research in the field of CVD aims to explore new diagnostic and/or prognostic biomarkers for their accurate and timely diagnosis, leading to immediate treatment of those patients and reduced morbidity and mortality rates. Necrosis and apoptosis of the myocardial cells that take place during acute myocardial infarction (AMI) result in the release of intracellular molecules, such as proteins and free nucleic acids (DNA/RNA), in the bloodstream. MicroRNAs (miRNAs-miRs) are small non-coding RNA molecules, 21-23 nucleotides in length, that regulate gene expression in eukaryotic organisms, either by inhibiting translation or promoting the degradation of specific RNAs (mRNAs). MiRs could be used for the early diagnosis of AMI, as they exhibit high stability in biological fluids and can be quantified by sensitive techniques. In addition, cell free DNA (cfDNA) could also consist a sensitive and reliable diagnostic AMI marker. Genetic factors also display an essential role as risk factors for the progress of CVD. Genetic polymorphisms in microRNA genes appear to affect their function and possibly contribute to the advance of these multifactorial diseases. The goal of the present PhD thesis is to investigate novel biomarkers that could be used for the early and accurate diagnosis of CVD, such as coronary artery disease (CAD) and AMI. Specifically, the three main axes of this thesis are: a) to quantitatively compare the expression levels of miR-208b and miR-499, which are associated with the cardiac function, in AMI patients and healthy individuals of the general population, b) to estimate the role of whole cfDNA, isolated from the plasma of AMI patients, as a biological marker for the early diagnosis of their condition, and c) to investigate the genetic polymorphisms (SNPs) miR146a G>C (rs2910164), miR149 C>T (rs2292832), miR196a2 C>T (rs11614913) and miR499 A>G (rs3746444) and their potential contribution in CAD and AMI prevalence. In the current study, samples derived from 400 individuals of Greek origin were analyzed: 200 CAD patients, 80 patients diagnosed with AMI and 200 healthy people of the general population, who served as the control group. Quantitative Real-Time PCR (qPCR) was used to quantify miR-208b and miR-499. The quantification of cfDNA was performed according to the following methods: 1) fluorescence reaction with Qubit 3.0 using ssDNA (single strand) assay kit and dsDNA HS (double strand) assay kit, 2) UV spectrophotometry using Nanodrop and 3) qPCR using TaqMan™ Copy Number Reference Assay, human, TERT. The quantification of cfDNA was made using different techniques, in order to evaluate their clinical application. The examination of the potential role of miR146a G>C (rs2910164), miR149 C>T (rs2292832), miR196a2 C>T (rs11614913) and miR499 A>G (rs3746444) genetic polymorphisms in the progress of CVD required comparative analysis of patient and control groups. Genotyping of patients and healthy subjects was executed using the following methodologies: 1) PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism), 2) High Resolution Melting Analysis (HRMA) and 3) Sanger sequencing. The results of this PhD thesis show that the relative expression of miR-208b and miR-499 microRNAs is dramatically increased in AMI patients compared with that observed in healthy controls (p<0.001). Specifically, in the patient group, plasma levels of miR-208b and miR-499 are augmented 256-fold and 675-fold, respectively. To evaluate the differential diagnosis of plasma circulating miR-208b and miR-499 in the diagnosis of AMI, the ROC curve is calculated. The area under the curve (AUC) of miR-208b is 0.9996 and of miR- 499 is 0.9992. The AUC of the two established biomarkers for the AMI diagnosis, cardiac troponin T (cTnT) and creatine kinase isoenzyme (CK-MB), whose plasma elevation is detected 4 to 6 hours following AMI, was 0.9400 and 0.9944, respectively; thereby highlighting the strong diagnostic value of these two microRNAs in clinical cardiology. The concentration of cf-DNA in the plasma of AMI patients was significantly higher than that of healthy controls (p<0.05). Quantification, using ss-DNA, presents the highest concentrations of cf-DNA, compared to those recorded using ds-DNA and NanoDrop. These measurements approach the values reported by the qPCR methodology, which is an accurate, but expensive and time consuming technique. Finally, the results of this PhD thesis reveal that there is a statistically significant difference in the genotypes and alleles frequencies among CAD/AMI and control groups (p<0.05) for miR196a2 C>T (rs11614913) and miR499 A>G (rs3746444) microRNA polymorphisms. For miR146a rs2910164G>C and miR149 rs2292832C> T polymorphisms, no statistically significant difference is observed among CAD/AMI patients and healthy individuals both for genotype and allele frequencies (p>0.05). The combinatorial study of the four polymorphisms (using Haploview program) indicates a statistically significant difference for the miR-499G -miR196T-miR146C-miR149C combination (p=0.0487), with a higher frequency in the group of patients diagnosed with CAD/AMI. In conclusion, miR-208b and miR-499 microRNAs could consist significant biomarkers for the valid and timely diagnosis of patients suffering from AMI. Their application as AMI biomarkers is more accurate, faster, and less expensive than the methodologies applied to date. Free extracellular DNA could also be considered as a biomarker for the diagnosis of AMI. Its quantification could be performed simply and rapidly using more cost-effective methodologies than qPCR. Moreover, miR196a2 (rs11614913) and miR499 (rs3746444) polymorphisms, and the haplotype miR-499G-miR196T-miR146C-miR149C seem to act as risk factors for CVD occurrence in the Greek population. Therefore, the results of this thesis, individually or combinatorially, are expected to contribute to the suggestion of new biomarkers for AMI and to the clarification of the role of genetic polymorphisms of specific microRNAs as risk factors for CVD.

Τα καρδιαγγειακά νοσήματα αποτελούν την πιο συχνή αιτία θανάτων παγκοσμίως. Η σύγχρονη έρευνα στο πεδίο των καρδιαγγειακών νοσημάτων έχει ως στόχο να προτείνει βιοδείκτες διάγνωσης και/ή πρόγνωσης, οι οποίοι θα παρέχουν την ακριβή και έγκαιρη διάγνωση των ασθενειών αυτών, με στόχο την άμεση αντιμετώπισή τους, και τη μείωση του ποσοστού νοσηρότητας και θνησιμότητας στον ανθρώπινο πληθυσμό. H νέκρωση και η απόπτωση των μυοκαρδιακών κυττάρων που συμβαίνουν κατά το Οξύ Έμφραγμα του Μυοκαρδίου (ΟΕΜ), έχουν ως αποτέλεσμα ενδοκυττάρια μόρια, όπως πρωτεΐνες και ελεύθερα νουκλεΐκα οξέα (DNA/RNA), να περνούν στη κυκλοφορία του αίματος. Τα microRNAs (miRNAs-miRs) είναι μικρά μη-κωδικοποιούντα μόρια RNA, μήκους 21-23 νουκλεοτιδίων, τα οποία ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, είτε αναστέλλοντας τη μετάφραση είτε προωθώντας την αποδόμηση συγκεκριμένων μεταγράφων RNAs (mRNAs). Τα miRs θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την έγκαιρη διάγνωση του ΟΕΜ, καθώς εμφανίζουν μεγάλη σταθερότητα στα βιολογικά υγρά και μπορούν με ευαίσθητες τεχνικές να προσδιοριστούν ποσοτικά. Επιπλέον, το ελεύθερο εξωκυτταρικό DNA (cell free DNA-cfDNA) θα μπορούσε να αποτελέσει ευαίσθητο και αξιόπιστο δείκτη διάγνωσης του ΟΕΜ. Στους παράγοντες κινδύνου για την εκδήλωση καρδιαγγειακών νοσημάτων σημαντικό ρόλο παίζουν και γενετικοί παράγοντες. Γενετικοί πολυμορφισμοί στα γονίδια των microRNAs φαίνεται να επηρεάζουν τη λειτουργία τους και είναι πιθανόν να συμβάλουν στην εκδήλωση των πολυπαραγοντικών αυτών νοσημάτων. Σκοπός της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής είναι η αναζήτηση νέων βιοδεικτών που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την έγκαιρη και ακριβή διάγνωση καρδιαγγειακών νοσημάτων, όπως είναι η Στεφανιαία Νόσος (ΣΝ) και το ΟΕΜ. Ειδικότερα, οι τρεις βασικοί στόχοι της παρούσας Διατριβής είναι: α) ο συγκριτικός ποσοτικός προσδιορισμός των επιπέδων έκφρασης των miR-208b και miR-499, τα οποία σχετίζονται με την καρδιακή λειτουργία, σε ασθενείς που έχουν υποστεί ΟΕΜ και σε υγιή άτομα του γενικού πληθυσμού, β) η εκτίμηση της δυνατότητας χρησιμοποίησης του ολικού cfDNA, που απομονώνεται από το πλάσμα ασθενών με ΟΕΜ, ως βιολογικού δείκτη για την έγκαιρη διάγνωση ΟΕΜ ασθενών και γ) η διερεύνηση των γενετικών πολυμορφισμών (SNPs) miR146a G>C (rs2910164), miR149 C>Τ (rs2292832), miR196a2 C>T (rs11614913) και miR499 A>G (rs3746444), για την πιθανή συσχέτισή τους με την εκδήλωση των ΣΝ και ΟΕΜ.Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν δείγματα από 400 άτομα Ελληνικής καταγωγής: 200 ασθενείς με διάγνωση ΣΝ, από τους οποίους οι 80 παρουσίασαν ΟΕΜ, και 200 υγιή άτομα του γενικού πληθυσμού, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα ελέγχου. Η μεθοδολογία που ακολουθήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό των miR-208b και miR-499 ήταν η ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (quantitative Real-Time PCR-qPCR). Ο ποσοτικός προσδιορισμός του cfDNA έγινε με τις παρακάτω μεθόδους: 1) αντίδραση φθορισμού με το Qubit 3.0 με τη χρήση ssDNA (single strand) assay kit και dsDNA HS (double strand) assay kit, 2) φασματοφωτομετρία UV με την χρήση Nanodrop και 3) qPCR με την χρήση του TaqMan™ Copy Number Reference Assay, human, TERT. Ο ποσοτικός προσδιορισμός του cfDNA έγινε με διαφορετικές μεθοδολογίες, με σκοπό την αξιολόγησή τους όσον αφορά στην κλινική τους εφαρμογή. Η διερεύνηση του πιθανού ρόλου των γενετικών πολυμορφισμών miR146a G>C (rs2910164), miR149 C>Τ (rs2292832), miR196a2 C>T (rs11614913) και miR499 A>G (rs3746444) στην εκδήλωση καρδιαγγειακών νοσημάτων έγινε με συγκριτική μελέτη ασθενών-υγιών ατόμων (μαρτύρων). Πραγματοποιήθηκε γονοτύπιση σε ασθενείς και υγιή άτομα με τις παρακάτω μεθοδολογίες: 1) PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism-Πολυμορφισμός Μήκους Περιοριστικών Θραυσμάτων), 2) Υψηλής Ευκρίνειας Ανάλυση Αποδιάταξης (High Resolution Melting Analysis - HRMA), 3) Αλληλούχιση κατά Sanger. Τα αποτελέσματα της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής έδειξαν ότι η σχετική έκφραση των microRNAs miR-208b και miR-499 είναι δραματικά αυξημένη στους ασθενείς που έχουν υποστεί ΟΕΜ, σε σύγκριση με εκείνη που παρατηρείται στα υγιή άτομα της ομάδας ελέγχου (p<0.001). Συγκεκριμένα, τα επίπεδα των miR-208b και miR-499 στο πλάσμα αυξήθηκαν κατά 256 φορές και 675 φορές, αντίστοιχα, στους ΟΕΜ ασθενείς. Για να εκτιμηθεί η διαφοροδιαγνωστική αξία των miR-208b και miR-499 που κυκλοφορούν στο πλάσμα στη διάγνωση του ΟΕΜ υπολογίστηκε η καμπύλη ROC (ROC curve) και η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) του miR-208b είναι 0.9996 και του miR-499 είναι 0.9992. Η AUC των δύο ήδη καθιερωμένων βιοδεικτών για τη διάγνωση του ΟΕΜ, της καρδιοειδικής τροπονίνης Τ (cTnT) και του ισοενζύμου της κινάσης της κρεατίνης (CK-MB), των οποίων η αύξηση στο πλάσμα ανιχνεύεται 4 έως 6 ώρες μετά το ΟΕΜ, είναι 0.9400 και 0.9944 αντίστοιχα, αναδεικνύοντας, ως εκ τούτου, την ισχυρή διαγνωστική αξία των δύο εν λόγω microRNAs στην κλινική καρδιολογική πράξη. Η συγκέντρωση του cf-DNA στο πλάσμα των ασθενών που έχουν υποστεί ΟΕΜ ήταν σημαντικά υψηλότερη, σε σύγκριση με εκείνη των υγιών μαρτύρων (p<0.05). Η ποσοτικοποίηση, χρησιμοποιώντας το ss-DNA, έδειξε τις υψηλότερες συγκεντρώσεις cf-DNA, σε σύγκριση με εκείνες που καταγράφηκαν με το ds-DNA και το NanoDrop. Οι μετρήσεις αυτές προσεγγίζουν τις τιμές που παρατηρήθηκαν με τη μεθοδολογία qPCR, η οποία είναι ακριβής, αλλά δαπανηρή και χρονοβόρα. Τέλος, τα αποτελέσματα της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής ανέδειξαν ότι για τους microRNA πολυμορφισμούς miR196a2 C>T (rs11614913) και miR499 A>G (rs3746444) υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά στις συχνότητες γονοτύπων και αλληλομόρφων ανάμεσα στις ομάδες των ΣΝ/ΟΕΜ ασθενών και στην ομάδα ελέγχου (p<0.05). Για τους πολυμορφισμούς miR146a rs2910164G>C και miR149 rs2292832C>T δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των ΣΝ/ΟΕΜ ασθενών και των υγιών ατόμων τόσο όσον αφορά στις συχνότητες των γονοτύπων όσο και των αλληλομόρφων (p>0.05). Η συνδυαστική μελέτη των τεσσάρων πολυμορφισμών (πρόγραμμα Haploview) έδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά για το συνδυασμό miR-499G - miR196T - miR146C - miR149C (p=0.0487), με μεγαλύτερη συχνότητα στην ομάδα των ασθενών με διάγνωση ΣΝ. Συμπερασματικά, τα microRNAs miR-208b και miR-499 θα μπορούσαν να αποτελέσουν σημαντικούς βιοδείκτες για την έγκυρη και ακριβή διάγνωση ασθενών που έχουν υποστεί ΟΕΜ. Η χρήση τους ως βιοδεικτών για τη διάγνωση του ΟΕΜ είναι πιο ακριβής, πιο γρήγορη και έχει μικρότερο κόστος σε σχέση με τις μεθοδολογίες που χρησιμοποιούνται σήμερα. Το ελεύθερο εξωκυτταρικό DNA θα μπορούσε, επίσης, να αποτελέσει βιοδείκτη για τη διάγνωση του ΟΕΜ. Η ποσοτικοποίηση μπορεί να γίνει εύκολα και γρήγορα χρησιμοποιώντας μεθοδολογίες πιο οικονομικές σε σχέση με την qPCR. Επιπλέον, οι πολυμορφισμοί miR196a2 (rs11614913) και miR499 (rs3746444), και ο απλότυπος miR-499G-miR196T-miR146C-miR149C φαίνεται ότι αποτελούν προδιαθεσικούς παράγοντες για την εκδήλωση καρδιαγγειακών νοσημάτων στον Ελληνικό πληθυσμό. Σύμφωνα με όλα τα παραπάνω, τα αποτελέσματα της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής, μεμονωμένα ή συνδυαστικά, αναμένεται να συμβάλουν στην πρόταση νέων βιοδεικτών για το ΟΕΜ και στη διαλεύκανση του ρόλου γενετικών πολυμορφισμών συγκεκριμένων microRNAs ως προδιαθεσικών παραγόντων για την εκδήλωση καρδιαγγειακών νοσημάτων.