Εργαστηριακή ανίχνευση, ταυτοποίηση και γονιδιακή ανάλυση των νοροϊών, αδενοϊών, ροταϊών, αστροϊών του ανθρώπου με σύγχρονες μοριακές τεχνικές

Abstract

Noroviruses, Rotaviruses, Adenoviruses and Astroviruses constitute important human pathogens which cause gastroenteritis illness. Noroviruses, Rotaviruses and Astroviruses contain RNA genome therefore manifesting increased genetic variability, while Adenoviruses which are DNA viruses, are less prone to genetic variation. The genetic groups correlated to gastroenteritis illness in humans are Norovivirus GI, GII and GIV, Rotaviruses group A G1, G2, G3, G4, G9 and G12, and for Astroviruses serotypes *HastV 1-8. Epidemiological data for Greece concerning viral gastroenteritis due to Noroviruses, Rotaviruses, Adenoviruses and Astroviruses are less compared to relative data from developed countries. In the present dissertation, research was performed at the molecular level for the identification and genetic analysis of viral strains which cause gastroenteritis in humans with the aim to recognize their genotypic profile and genetic variation. In parallel, an attempt was made to evaluate diagnostic methods used for their detection in the clinical laboratory. A total of 640 diarrheal stool samples were collected from hospitalized patients during the period 2008-2013 and sent by clinics of University hospital in Larissa to the microbiology laboratory for the detection of enteropathogens. Part of the sample was collected and stored at -80oC. Patient data were registered (sex, age, date). All samples were screened using real time PCR where there were detected 105 positive samples for Rotaviruses, 51 positive for Norovivirus, 23 positive for Adenoviruses and 2 positive for Astroviruses. The high number of positive samples to Rotaviruses is explained by the low infectious dose, the increased viral load excreted in stools and increased resistance Rotaviruses exhibit in environmental conditions. Positive samples were screened by conventional PCR to determine genotypes. In Rotaviruses, type G4P[8] was mostly detected followed by G1P[8]. During our study there was performed the typing of a significant number of Rotaviruses from clinical samples by multiplex PCR. In Noroviruses, 47 were typed as GII and 4 as GI. In further molecular typing of positive samples by Real Time PCR, six type GII viruses were found to belong to genotype GII.4 while one virus of type GI to genotype GI.2. Phylogenetic analysis of viral sequences showed that the majority of these viruses were identical to circulating viral strains, worldwide. Concerning the evaluation of diagnostic approaches to Rotavirus detection employed in the clinical laboratory, there were compared an immunochromatography assay (ICT), a conventional PCR, and a real time RT-PCR, which showed that the sensitivity of ICT and cPCR are about the same, with values of 75,24% and 77,14%, respectively.

Οι Νόροϊοι, Ρόταϊοι, Αδένοϊοι και Άστροϊοι αποτελούν σημαντικά παθογόνα του ανθρώπου που σχετίζονται με την πρόκληση γαστρεντερίτιδας. Οι Νόροϊοι, Ρόταϊοι και Άστροϊοι είναι RNA ιοί γεγονός που τους καθιστά ευμετάβλητους ενώ οι Αδένοϊοι έχοντας γονιδίωμα DNA είναι λιγότερο επιρρεπείς στις γενετικές αναδιατάξεις. Οι γενετικές ομάδες που έχουν συσχετισθεί με πρόκληση γαστρεντερίτιδας στον άνθρωπο είναι για τους Νόροϊους GI, GII και GIV, για τους Ρόταϊους της ομάδας Α οι G1, G2, G3, G4, G9 και G12, για τους Αδένοϊους οι ορότυποι 40 και 41, για τους Άστροϊούς οι ορότυποι HastV 1-8. Τα επιδημιολογικά δεδομένα για την Ελλάδα όσον αφορά τις γαστρεντερίτιδες ιογενούς αιτιολογίας οφειλόμενες στους Νόροϊους, Ρόταϊους, Αδένοϊους και Άστροϊους είναι λιγότερα συγκριτικά με τα αντίστοιχα των αναπτυγμένων χωρών. Στην παρούσα διατριβή, πραγματοποιήθηκε έρευνα σε μοριακό επίπεδο για την ταυτοποίηση και γονιδιακή ανάλυση των ιικών στελεχών που προκαλούν γαστρεντερίτιδα στον άνθρωπο με στόχο να αναγνωριστεί το γενοτυπικό προφίλ τους και τυχόν μεταβολές αυτού. Παράλληλα, επιδιώκεται και μία εκτίμηση των διαγνωστικών προσεγγίσεων που χρησιμοποιούνται στο κλινικό εργαστήριο για την ανίχνευση τους. Για την επίτευξη των στόχων συλλέχθηκαν 640 διαρροϊκά δείγματα κοπράνων από νοσηλευόμενους ασθενείς κατά τη χρονική περίοδο 2008-2013 που είχαν αποσταλεί από τις κλινικές του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Λάρισας στο εργαστήριο μικροβιολογίας για την αναζήτηση εντεροπαθογόνων. Μέρος του δείγματος, συλλέχθηκε και αποθηκεύτηκε σε συνθήκες βαθιάς κατάψυξης (-80 oC). Καταγράφηκαν στοιχεία σχετικά με φύλο, ηλικία και ημερομηνία. Στο σύνολο των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε screening με real time PCR όπου ανιχνεύθηκαν 105 δείγματα θετικά σε Ρόταϊους, 51 δείγματα θετικά σε Νόροϊους,23 θετικά σε Αδένοϊους και 2 θετικά δείγματα σε Άστροϊους. Το υψηλό ποσοστό θετικών δειγμάτων σε Ρόταϊους αιτιολογείται από τη μικρή μολυσματική δόση, το μεγάλο ιικό φορτίο που αποβάλλεται στα κόπρανα και την αυξημένη ανθεκτικότητα που παρουσιάζει ο ιός στις περιβαλλοντικές συνθήκες. Στα θετικά δείγματα ακολούθησε συμβατική PCR για τον καθορισμό των γονιδιακών τύπων. Στους Ρόταϊους, ο πιο συχνός τύπος που ανιχνεύθηκε ήταν ο G4P[8] και ο αμέσως επόμενος ήταν ο G1P[8]. Κατά τη μελέτη μας πραγματοποιήθηκε και η τυποποίηση ενός σημαντικού αριθμού θετικών δειγμάτων Ροταϊών με τη χρήση multiplex PCR. Στους Νόροϊους τα 47 εξ’ αυτών τυποποιήθηκαν ως GII και τα 4 ως GI. Σε ενδεικτική περαιτέρω μοριακή τυποποίηση θετικών με τη Real Time PCR δειγμάτων, έξι δείγματα τύπου GII βρέθηκε ότι ανήκουν στο γενότυπο GII.4 ενώ ένα δείγμα του τύπου GI ανήκε επίσης στο γενότυπο GI.2. Η φυλογενετική ανάλυση επέδειξε ότι όλα τα στελέχη των οποίων οι αλληλουχίες αναγνώστηκαν είναι όμοια σε μεγάλο βαθμό με στέλεχη που κυκλοφορούν παγκοσμίως. Στην εκτίμηση των διαγνωστικών προσεγγίσεων που χρησιμοποιούνται στο κλινικό εργαστήριο για την ανίχνευση της παρουσίας ρόταϊων πραγματοποιήθηκε σύγκριση ανοσοχρωματογραφικού τεστ ICT, συμβατικής PCR, και real time RT-PCR όπου διαπιστώθηκε ότι η ευαισθησία του ανοσοχρωματογρα-φικού τεστ (ICT) και της συμβατικής cPCR είναι σχεδόν παρόμοια με τιμές 75,24% και 77,14% αντίστοιχα.