Ανάπτυξη και έλεγχος μεθοδολογιών για γονιδιωματικές αναλύσεις άγριων και καλλιεργούμενων πληθυσμών τσιπούρας (Sparus aurata)

Abstract

Gilthead sea bream (Sparus aurata) is a key target for fisheries and the subject of intensive farming in Greek seas. Farmed stocks may be genetically different from local wild populations as a result of domestication. Additionally, the origin of the breeders is usually different than the aquaculture area while the selection programmes boost the genetic difference with the local populations. Based on the high commercial value of the species, genetic differentiation studies and the development of a molecular tool for the genetic identification of individuals is highly desirable, for both customer/company assurance of fish origin, the control and detection of escapees and fisheries management. In the context of this doctoral dissertation, the population structure of wild and farmed sea bream populations, from across the species’ expansion range in Greece, has been genetically examined with microsatellite markers as well as with SNPs and a genetic traceability tool has been developed. We examined 662 gilthead sea bream wild individuals from the Aegean and Ionian Seas, using 20 EST-linked microsatellite markers, in three multiplex panels, as well as seven anonymous loci. We found low genetic differentiation between the sampling stations/areas with a total FST value 0.002 (P<0.05). Based on the comparison of the five temporal samples, our results indicate genetic data consistency over time for all tested samples, pointing to stable populations, despite reported repeated escape events. To elucidate furthermore the genetic population structure, 5 farmed and 9 wild population samples, have been analysed using ddRAD sequencing (878 individuals in total). 1.173 SNPs were assessed and genetic differentiation has been noticed between Ionian and Aegean populations (FST <0.01, P≤0.05) but mainly between wild and farmed populations (FST up to 0.055, P≤0.05). Farmed populations were clustered in two main groups with one population to be differentiated from the clusters (FST up to 0.05, P≤0.05). At European level, wild Greek populations differ significantly from the European farmed populations as well as from the European wild populations. Additionally, based on the significant genetic differentiation of wild and farmed populations, a robust panel of 15 SNPs was developed, and planned for validation, for the discrimination of wild and farmed individuals. The selected SNPs are the most informative for this discrimination and they are reliable with a low cost of genotyping. The panel performs with high assignment accuracy for both wild and farmed individuals in a range of 85-100% of success for the assignment of individuals back to the parental group of origin. The validation plan focused on testing the repeatability, robustness, sensitivity and reproducibility of the SNP panel. The validated SNP panel was applied on a case study for the identification of wild and farmed individuals in the Greek market. The results of the case study indicate a few cases of fraud and/or escapees. The outcome of the dissertation provides a baseline for future reference in any management programme of both wild and farmed population of sea bream as well as of other aquaculture species with a potential introgression among farmed and wild populations. The proposed management actions could contribute to the sustainable management of the wild and farmed stocks of the species.

Η τσιπούρα (Sparus aurata) είναι ένα από τα πλέον σημαντικά εμπορικά είδη και αντικείμενο εντατικής καλλιέργειας στην Ελλάδα. Οι καλλιεργούμενοι πληθυσμοί μπορεί να διαφέρουν σημαντικά γενετικά από τους τοπικούς φυσικούς πληθυσμούς, λόγω των μεθόδων εκτροφής. Επιπρόσθετα, η προέλευση των γεννητόρων συνήθως είναι διαφορετική από τον τόπο εκτροφής ενώ τα προγράμματα επιλογής ενισχύουν τις γενετικές διαφορές με τους τοπικούς πληθυσμούς. Η μεγάλη εμπορική αξία του είδους και η αειφορική διαχείριση των πληθυσμών καθιστούν αναγκαία τη μελέτη της πληθυσμιακής δομής του είδους και την ανάπτυξη εργαλείων ιχνηλασιμότητας, για τη διασφάλιση των προμηθευτών, του καταναλωτή αλλά και της γενετικής ποικιλομορφίας τους είδους. Στη διδακτορική αυτή διατριβή, μελετήθηκε η πληθυσμιακή δομή φυσικών και καλλιεργούμενων πληθυσμών τσιπούρας στα ελληνικά ύδατα, χρησιμοποιώντας ως γενετικούς μάρτυρες το μικροδορυφορικό DNA αλλά και απλούς νουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς (SNPs). Επίσης, αναπτύχθηκε ένα μοριακό εργαλείο ιχνηλασιμότητας σε επίπεδο ατόμου. Αρχικά, αναλύθηκαν 662 φυσικά άτομα τσιπούρας από το Αιγαίο και το Ιόνιο πέλαγος με τη χρήση 20 μικροδορυφορικών τόπων από εκφραζόμενες περιοχές του DNA και 7 ουδέτερων τόπων. Βρέθηκε χαμηλή γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των φυσικών πληθυσμών με συνολική FST 0,002 (P≤0,05). Η ανάλυση των εποχιακών επαναδειγματοληψιών έδειξε γενετική σταθερότητα των πληθυσμών σε βάθος χρόνου, παρά τις καταγεγραμμένες διαφυγές καλλιεργούμενων ατόμων στο φυσικό περιβάλλον. Στη συνέχεια, για την περαιτέρω εμβάθυνση στη μελέτη της πληθυσμιακής διαφοροποίησης, αναλύθηκαν 5 καλλιεργούμενοι και 9 φυσικοί πληθυσμοί (878 άτομα), με τη χρήση 1.173 SNPs που προέκυψαν από NGS. Με τη μεγαλύτερη αναλυτική ισχύ των SNPs, εντοπίστηκε σαφέστερη γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των φυσικών πληθυσμών του Αιγαίου και του Ιονίου πελάγους (FST <0,01, P≤0,05) αλλά και σημαντική γενετική διαφοροποίηση μεταξύ φυσικών και καλλιεργούμενων πληθυσμών (FST μέχρι και 0.055, P≤0,05). Οι καλλιεργούμενοι πληθυσμοί ομαδοποιήθηκαν γενετικά σε δύο ομάδες, με έναν πληθυσμό να διαφοροποιείται από τις δύο ομάδες (FST μέχρι και 0,05, P≤0,05). Σε ευρωπαϊκό επίπεδο, οι φυσικοί πληθυσμοί του Αιγαίου και του Ιονίου διαφοροποιούνται σημαντικά από τους πληθυσμούς του Ατλαντικού αλλά και της Δυτικής Μεσογείου. Επιπρόσθετα, βάσει της έντονης γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ φυσικών και καλλιεργούμενων πληθυσμών, κατασκευάστηκε και σχεδιάστηκε η επικύρωση, ενός αξιόπιστου πάνελ με 15 SNPs για την ανάθεση ατόμων τσιπούρας στον πληθυσμό προέλευσης (φυσικά/καλλιεργούμενα). Τα επιλεγμένα SNPs είναι τα πλέον πληροφοριακά για αυτή τη διάκριση και προσφέρουν αξιοπιστία και χαμηλό κόστος γενοτύπησης. Το πάνελ παρουσιάζει υψηλή ακρίβεια, με το ποσοστό επιτυχούς ανάθεσης να ανέρχεται σε 85-100% για την διάκριση φυσικών και καλλιεργούμενων ατόμων. Ο σχεδιασμός επικύρωσης εστιάστηκε στον έλεγχο της σταθερότητας, της πιστότητας, της ευαισθησίας και της επαναληψιμότητας του πάνελ, ώστε να μπορεί το εργαλείο να χρησιμοποιηθεί με αξιοπιστία από τον τελικό χρήστη. Το επικυρωμένο εργαλείο εφαρμόστηκε σε μια μελέτη περίπτωσης για τον προσδιορισμό του πληθυσμού προέλευσης, φυσικών και καλλιεργούμενων ατόμων από την ελληνική αγορά. Κατά τη μελέτη περίπτωσης εντοπίστηκαν κάποιες περιπτώσεις απόπειρας εξαπάτησης ή/και διαφυγόντων καλλιεργούμενων ατόμων τσιπούρας. Τα αποτελέσματα της διδακτορικής διατριβής αποτελούν μια πολύτιμη βάση αναφοράς και εργαλείο για προγράμματα διαχείρισης πληθυσμών τσιπούρας αλλά και άλλων καλλιεργούμενων ειδών με πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ φυσικών και καλλιεργούμενων ατόμων. Οι διαχειριστικές προτάσεις που παρατίθενται συμβάλλουν στην αειφορική διαχείριση των πληθυσμών του είδους.