Μοριακή επιδημιολογία κλινικών στελεχών acinetobacter spp. ανθεκτικών στις καρβαπενέμες

Abstract

The hospital-acquired infections caused by Acinetobacter spp. have been recently increased globally. They cause mainly respiratory infections, bacteremia, meningitis and urinary tract infections, mainly in ICU patients. Risk factor is the previous antibiotic therapy. Carbapenems are considered the antibiotic of choice. An increase of carbapenem resistant Acinetobacter spp. has been observed during the recent years. The majority of resistant Acinetobacter spp., responsible for the hospital-acquired infections, belongs to Acinetobacter baumannii species. The aim of the present study was the investigation of the mechanisms providing resistance to carbapenems to clinical Acinetobacter spp. isolates, and the molecular typing of them in order to identify the circulating clones. During the time period 2001-2008, a number of 168 non-repetitive carbapenem resistant Acinetobacter spp. isolates, recovered from patients hospitalized in different wards of the Papageorgiou Hospital, have been tested. Isolates were initially identified on the basis of biochemical properties with the Wider automated system. Antibiotic sensitivity was tested with the same automated system. In addition, E-test and agar dilution method were applied to check the sensitivity to carbapenems. Polymerase chain reaction (PCR) was performed for the identification of the isolates, for the detection of genes providing resistance to carbapenems (blaVIM, blaIMP, blaOXA-23-like, blaOXA-24-like, blaOXA-51-like, blaOXA-58, blaCarO, and the insertion sequencing ISAba1), and for the detection and characterization of integrase genes. Sequencing of the blaOXA-58 gene PCR product was performed for confirmation of the results. Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) and the Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) were applied for the epidemiological typing of the isolates. The obtained images were analysed using GelCompar program of the BioNumerics software (Applied Maths NV). It was shown that most of the carbapenem resistant Acinetobacter spp. isolates (164/168 97.6%) belonged to Acinetobacter baumannii species. The majority of the isolates (159/164 96.9%) were carrying the blaOXA-58 gene, which seems to confired the resistance to carbapenems, while the resistance of the rest strains (5/164, 3.1%) seems to be caused by the combination of the intrinsic gene blaOXA-51 with the element ISAba1. Metallo-β-lactamase was identified in one sole isolate, which was identified as Acinetobacter genomospecies 16. Class 1 integrons of 2.2 kb, 2.5 kb and 3.1 kb were identified from the isolates. The Acinetobacter baumannii isolates of the study were divided into 5 distinct clones (A, B, C, D, E). Clone A isolates were carrying the blaΟΧΑ-58 gene, as well as a class 1 integron of 2.2 kb. Clone A was further subdivided into subclones A1 and A2. The majority of the strains (115/164, 70.1%) belonged to A1 subclone. In conclusion, molecular epidemiology of carbapenem resistant Acinetobacter spp. isolates provides useful data for the extent of their distribution in the hospital, for the prompt detection of new genetic clones, and for the efficacy of control measures applied for the prevention of epidemic clones dissemination.

Ο αριθμός των νοσοκομειακών λοιμώξεων από ακινητοβακτηρίδιο (Acinetobacter spp.) αυξήθηκε παγκoσμίως τα τελευταία έτη. Οι κυριότερες λοιμώξεις που προκαλούν είναι οι λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος, η βακτηριαιμία, η μηνιγγίτιδα και οι ουρολοιμώξεις, και παρατηρούνται κυρίως σε ασθενείς των Μονάδων Εντατικής Θεραπείας. Σημαντικός προδιαθεσικός παράγοντας είναι η προηγηθείσα αντιβιοτική θεραπεία. Οι καρβαπενέμες θεωρούνται το αντιμικροβιακό φάρμακο επιλογής για την καταπολέμηση αυτών των λοιμώξεων. Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια παρατηρείται αύξηση του αριθμού των ανθεκτικών στις καρβαπενέμες ακινητοβακτηριδίων. Το μεγαλύτερο ποσοστό των ανθεκτικών στις καρβαπενέμες ακινητοβακτηριδίων που εμπλέκονται στις νοσοκομειακές λοιμώξεις, ανήκουν στο είδος Acinetobacter baumannii. Σκοπός της μελέτης αυτής ήταν η μελέτη των μηχανισμών αντοχής κλινικών στελεχών Acinetobacter spp. ανθεκτικών στις καρβαπενέμες, και η μοριακή τυποποίηση των στελεχών αυτών ώστε να γίνει επιδημιολογική μελέτη για την ανεύρεση των πιθανώς κυκλοφορούντων κλώνων. Κατά τα έτη 2001-2008 μελετήθηκαν 168 ανθεκτικά στις καρβαπενέμες στελέχη Acinetobacter spp., που απομονώθηκαν από ισάριθμους ασθενείς, που νοσηλεύθηκαν σε διάφορες κλινικές του Νοσοκομείου Παπαγεωργίου. Η αρχική ταυτοποίηση των στελεχών έγινε με βάση τις βιοχημικές ιδιότητες του βακτηρίου με το αυτόματο σύστημα Wider. Στο ίδιο αυτόματο σύστημα έγινε και ο έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμικροβιακά φάρμακα. Για τον έλεγχο ευαισθησίας των στελεχών στις καρβαπενέμες χρησιμοποιήθηκε το E-test, καθώς και η μέθοδος των αραιώσεων των αντιβιοτικών σε άγαρ. Η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιήθηκε για την τελική τυποποίηση των στελεχών, για τον έλεγχο των γονιδίων blaVIM, blaIMP, blaOXA-23-like, blaOXA-24-like, blaOXA-51-like, blaOXA-58, blaCarO, για την ενθετική αλληλουχία ISAba1, για την ανίχνευση των γονιδίων ιντεγκράσης, καθώς και για την ενίσχυση ολόκληρου του ιντεγκρονίου. Στα προϊόντα της PCR για το γονίδιο blaOXA-58 εφαρμόσθηκε για επιβεβαίωση ο προσδιορισμός νουκλεοτιδικής άλληλουχίας προϊόντων της PCR (DNA sequencing). Για την επιδημιολογική μελέτη των στελεχών εφαρμόσθηκαν η αποτύπωση τυχαία πολλαπλασιασμένου πολυμορφικού DNA (Randomly Amplified Polymorphic DNA, RAPD) και η ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE). Οι εικόνες που ελήφθησαν από την εφαρμογή αυτών των δύο μεθόδων αναλύθηκαν με τη χρήση του προγράμματος GelCompar του λογισμικού πακέτου BioNumerics (Applied Maths NV). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα περισσότερα (164/168, 97,6%) ανθεκτικά στις καρβαπενέμες στελέχη ακινητοβακτηριδίου που απομονώθηκαν ήταν Acinetobacter baumannii. Στην πλειονότητα των στελεχών της μελέτης (159/164, 96,9%), η αντοχή στις καρβαπενέμες φάνηκε να οφείλεται στην ύπαρξη του γονιδίου της οξακιλλινάσης OXA-58, ενώ στις υπόλοιπες των περιπτώσεων (5/164, 3,1%) στην ύπαρξη του συνδυασμού παρουσίας του εγγενούς γονιδίου blaOXA-51 με την ενθετική αλληλουχία ISAba1. Μεταλλο-β-λακταμάση ανιχνεύθηκε μόνο σε ένα στέλεχος Acinetobacter genomospecies 16. Τα ιντεγκρόνια που ανιχνεύθηκαν ήταν τάξης 1 και μεγέθους 2,2 kb, 2,5 kb και 3,1 kb. Τα στελέχη Acinetobacter baumannii της μελέτης αποτελούσαν 5 διακριτούς κλώνους ((A, Β, Γ, Δ, Ε). Τα στελέχη του κλώνου Α έφεραν το γονίδιο αντοχής στις καρβαπενέμες blaΟΧΑ-58, καθώς και ιντεγκρόνιο τάξης 1, μεγέθους 2,2 kb. Ο κλώνος Α υποδιαιρέθηκε περαιτέρω σε δύο υποκλώνους, τους Α1 και Α2. Η πλειονότητα των στελεχών (115/164, 70,1%) ανήκε στον υποκλώνο Α1. Εξάγεται το συμπέρασμα ότι η μοριακή επιδημιολογία ανθεκτικών στις καρβαπενέμες στελεχών Acinetobacter spp. δίνει χρήσιμα στοιχεία όσον αφορά τη διασπορά τους στο νοσοκομειακό περιβάλλον, την ταχεία ανίχνευση νέων γενετικών κλώνων, και την αποτελεσματικότητα της εφαρμογής των μέτρων αντιμετώπισης της εξάπλωσης των επιδημικών στελεχών.