Ο ρόλος των μικρών πλούσιων σε λευκίνη πρωτεογλυκανών (SLRPs) στη συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων ανθρώπινου οστεοσαρκώματος

Abstract

Osteosarcomas comprise approximately 1% of total malignant tumors diagnosed every year and they have a mesenchymal origin. Osteosarcoma is the second most common primary bone tumor, after myeloma and 20% of all sarcomas of the bone are osteosarcomas. Its incidence is higher during the second decade and lower in the sixth decade of the human life. An important characteristic of osteosarcoma is its heterogeneity and ability to produce abundant non-mineralized ECM–osteoid, mainly consisting of collagen type I, glycoproteins, and proteoglycans (PGs)/GAGs (Benayahu et al., 2001; Nikitovic et al., 2013).The small leucine-rich proteoglycans (SLRPs) were originally defined as proteoglycans with a relatively small protein core (36–42 kDa) harboring tandem leucine-rich repeats and undergoing post-translational modifications, including substitution with glycosaminoglycan side chains of various types (Iozzo and Murdoch 1996; Iozzo 1997). Their ubiquitous tissue distribution and expression at strategic sites in embryogenesis and tissue repair, coupled with their protein conservation, suggests that SLRP functions are of no small consequence. Originally, the SLRPs were grouped into three distinct classes based on nucleotide and protein sequence conservation, the organization of disulfide bonds at their N and C termini, and their genomic organization (Iozzo 1997; Danielson et al., 1993). More recently, the SLRP gene family has expanded to encompass 18 genes classified into five distinct subfamilies (Schaefer and Iozzo 2008; Iozzo et al., 2011), additionally based on N-terminal Cys-rich clusters of the protein core and ear repeats (C-terminal repeats specific to SLRPs) (McEwan et al., 2006), chromosomal organization (Schaefer and Iozzo 2008; Iozzo et al., 2011), and, importantly, functional commonality in view of the fact that some SLRPs are not classical proteoglycans (Schaefer and Iozzo 2008). Thus, the canonical class I members decorin and biglycan contain chondroitin or dermatan sulfate side chains, whereas the more recently described asporin does not (Henry et al., 2001; Kisawa et al., 2005). On the other hand, all class II members bear keratan sulfate chains or polylactosamine in their leucine-rich repeats, whereas class III members carry keratan sulfate (osteoglycin), chondroitin/dermatan sulfate (epiphycan), or no glycosaminoglycan (opticin) chains (Schaefer and Iozzo 2008, Sanders et al., 2003). However, most non-canonical class IV and V members (Neame et al., 1994; Pusch et al., 2000; Ohta et al., 2006) unexpectedly lack any glycosaminoglycan chain, with the exception of chondroadherin, which is substituted with keratan sulfate (Neame et al., 1994). Therefore, the unique characteristics of their protein cores and the presence of glycosaminoglycans, together with specific post-translational modifications, notably changes in the degree of glycosaminoglycan epimerization or sulfation, characterize this class of proteoglycans with high structural complexity.The present PhD thesis investigated the role of two important SLRPs, lumican and biglycan, in the regulation of osteosarcoma cell function. Our research group has shown that human osteosarcoma cell lines express and secrete lumican partly substituted with keratan sulfate glycosaminoglycans Nikitovic et al., 2008. Lumican appears to have a role in osteosarcoma pathogenesis, as the growth of Saos 2 osteosarcoma cells was inhibited by lumican, whereas their migration and chemotactic response to fibronectin were found to be promoted (Nikitovic et al., 2008). These key tumor cell functions appear to be modulated through, crucial for bone tumor cells, Smad signaling pathway (Nikitovic et al., 2008). In this study, we examine the effect of lumican on osteosarcoma cell adhesion and investigate the hypothesis that lumican through the modulation of the pericellular availability of the transforming growth factor-beta (TGF-β) isoform/s regulates its downstream intracellular signaling and thus affects cell functions. Human osteosarcoma cell lines were recently shown to express and secrete the small leucine rich proteoglycan (SLRP) lumican, with the ability to regulate the growth and motility of these cells. In this study, lumican-deficient Saos 2 cells were demonstrated to have increased adhesive capability onto fibronectin (FN) (p≤0.01). Upon neutralization of endogenous transforming growth factor β2 (TGF-β2) activity, no difference in the ability of lumican siRNA-transfected and scramble siRNA-transfected Saos 2 cells to adhere onto FN was detected (p = NS). Exogenous TGF-β2 was shown to stimulate Saos 2 cell adhesion to FN (p≤0.01). These results therefore, suggest that the inverse correlation existing between lumican expression and Saos 2 cell adhesion is dependent on active TGF-β signaling. Furthermore, the significant increase in Smad 2 activation present in lumican-deficient cells (p≤0.01) was annulled in the presence of the anti-TGF-β2 peptide, demonstrating that lumican is an upstream regulator of the TGF-β2/Smad 2 signaling cascade. Crucial to FN-dependent adhesion, β1 integrin expression and pFAK activation were likewise identified as downstream TGF-β2 effectors regulated by lumican expression. In conclusion, this study demonstrates a novel out-in signaling circuit in human osteosarcoma cells: secreted to extracellular matrix lumican is an endogenous inhibitor of TGF-β2 activity, resulting in downstream effector modulation including pSmad 2, integrin β1 and pFAK to regulate osteosarcoma adhesion.Furthermore, this study investigated osteosarcoma cell function modulation of the equally important SLRP, biglycan.Biglycan, a small leucine rich proteoglycan (SLRP), is an important participant in bone homeostasis and development as well as in bone pathology. In the present study biglycan was identified as a positive regulator of MG63 osteosarcoma cell growth (p ≤ 0.001). IGF-I was shown to increase biglycan expression (p ≤ 0.01), whereas biglycan-deficiency attenuated significantly both basal and IGF-I induced cell proliferation of MG63 cells (p ≤ 0.001; p ≤ 0.01, respectively). These effects were executed through the IGF-IR receptor whose activation was strongly attenuated (p ≤ 0.01) in biglycan-deficient MG63 cells. Biglycan, previously shown to regulate Wnt/b-catenin pathway, was demonstrated to induce a significant increase in b-catenin protein expression evident at cytoplasmic (p ≤ 0.01), membrane (p ≤ 0.01), and nucleus fractions in MG63 cells (p ≤ 0.05). As demonstrated by immunofluorescence, increase in b-catenin expression is attributed to co-localization of biglycan with the Wnt co-receptor low-density lipoprotein receptor-related protein 6 (LRP6) resulting in attenuated b-catenin degradation. Furthermore, applying anti-b-catenin and anti-pIGF-IR antibodies to MG-63 cells demonstrated a cytoplasmic and to the membrane interaction between these molecules that increased upon exogenous biglycan treatment. In parallel, the downregulation of biglycan significantly inhibited both basal and IGF-I-dependent ERK1/2 activation, (p ≤ 0.001). In summary, we report a novel mechanism where biglycan through a LRP6/b-catenin/IGF-IR signaling axis enhances osteosarcoma cell growth (Aggelidakis et al., 2018).In summary, the results of this PhD thesis described two novel mechanisms with which two important cancer cell functions were modulated, adhesion and proliferation by lumican and biglycan respectively. These SLRPs are suggested to be used as target molecules for the regulation of osteosarcoma progression and maybe part of therapy treatments for tumors of mesenchymal origin.

Τα σαρκώματα συνιστούν το 1% περίπου του συνόλου των κακοήθων νεοπλασιών κάθε χρόνο, είναι μεσεγχυματικής προέλευσης και κατατάσσονται με βάση τον τύπο του ιστού προέλευσης τους. Το οστεοσάρκωμα είναι ένας όγκος υψηλής κακοήθειας, που χαρακτηρίζεται από την παρουσία νεοπλασματικών κυττάρων που παράγουν οστεοειδές. Αποτελεί τον δεύτερο σε συχνότητα πρωτοπαθή όγκο των οστών μετά το μυέλωμα και το 20% όλων των σαρκωμάτων των οστών. Το οστεοσάρκωμα εμφανίζεται πιο συχνά στην δεύτερη δεκαετία της ζωής και με μικρότερη συχνότητα στην έκτη δεκαετία. Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία (ECM) του οστεοσαρκώματος είναι πλούσια σε κολλαγόνο, γλυκοπρωτεϊνες και πρωτεογλυκάνες (Benayahuetal., 2001; Piepkornetal., 1988; Roughley, 2006).Οι πλούσιες σε λευκίνη πρτωτεογλυκάνες (SLRPs) αποτελούν κύρια μόρια της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας του συνδετικού ιστού και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των όγκων μεσεγχυματικής προέλευσης (Nikitovic et.al., 2012). Επίσης, οι SLRPs αποτελούν τις πιο άφθονες πρωτεογλυκάνες του οστεοειδούς (Waddington &L angley 1998; Young etal., 2005). Αλλαγές στην έκφραση των SLRPs έχουν παρατηρηθεί σε ποικιλία τύπων καρκινικών κυττάρων, όπως του οστεοσαρκώματος, του ινοσαρκώματος και του χονδροσαρκώματος. Τα μέλη της οικογένειας των SLRPs εμφανίζουν δομική ομοιομορφία και κατατάσσονται σε πέντε κατηγορίες (SchaeferandIozzo2008). Η κατηγορία Ι περιλαμβάνει την διακοσμιτίνη (decorin) και την διγλυκάνη (biglycan), η κατηγορία ΙΙ τις ινομοδουλίνη (fibromodulin), λουμικάνη (lumican), PRELP, κερατοκάνη (keratocan) και οστεοκατχερίνη (osteocadherin) καιηκατηγορία ΙΙ την επιφυκάνη (epiphycan) και οστεογλυκίνη/μιμεκάνη (asteoglycin/mimecan) (Hockingetal., 1998; Fisheretal., 1989; Oldbergetal., 1989; Blochbergeretal., 1992; Bengtssonetal., 1995; Sommarinetal., 1998; Friedman eta l., 2000). Επίσης, τελευταίες έχουν ανακαλυφτεί η οπτικίνη (opticin) και η ασπορίνη (asporin) (Reardon et al., 2000; Lorenzoetal., 2001). Οι κατηγορίες IVκαι V έχουν χαρακτηριστεί ως μη-κανονικές (SchaeferandIozzo 2008). Ο πρωτεϊνικός κορμός των SLRPs έχει μέγεθος 40-50 kDa με μοτίβα πλούσια σε λευκίνη, τα οποία επαναλαμβάνονται 9-10 φορές στο C-τελικό άκρο τους. Στην N-τελική περιοχή τους οι SLRPs φέρουν γλυκοζαμινογλυκανικές αλυσίδες με διαφορετική χημική σύσταση (Nikitovic et al., 2008; McEwanetal., 2006). Ο βαθμός το είδος γλυκοζυλίωσης φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην οστεογένεση και τη χονδρογένεση (Radaetal., 2000). Το χαρακτηριστικό σε σχήμα πετάλου αλόγου του πρωτεϊνικού τους κορμού, τους επιτρέπει να αλληλεπιδρούν με συστατικά της ECM, όπως οι αυξητικοί παράγοντες, επηρεάζοντας ποικίλες κυτταρικές λειτουργίες (Nikitovic et al., 2008; Nikitovic et al., 2012).Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε ο ρυθμιστικός ρόλος δύο σημαντικών SLRP, της λουμικάνης και της διγλυκάνης, στις κυτταρικές λειτουργίες του οστεοσαρκώματος. Οι κυτταρικές σειρές οστεοσαρκώματος έχει δειχθεί ότι εκφράζουν και εκκρίνουν την μικρή πλούσια σε λευκίνη πρωτεογλυκάνη (SLRP), λουμικάνη (Nikitovic et.al., 2008). Η λουμικάνη έχει προηγουμένως αποδειχτεί ότι ρυθμίζει την ανάπτυξη και την κινητικότητα των κυττάρων του οστεοσαρκώματος. Στην έρευνα της παρούσας διατριβής, κύτταρα οστεοσαρκώματος της κυτταρικής σειράς Saos 2 ελλειπή σε έκφραση λουμικάνης παρουσίασαν αυξημένη κυτταρική προσκόλληση σε υπόστρωμα ινονεκτίνης (FN) (p≤0.01). Μελετήθηκε επίσης η δράση του αυξητικού παράγοντα transforming growth factor β2 (TGF- β2). Η εξωγενής προσθήκη του TGF- β2 αύξησε στατιστικά σημαντικά την προσκόλληση των κυττάρων στην FN (p≤0.01). Αντιθέτως, η μείωση της δράσης του παράγοντα αυτού δεν άλλαξε την ικανότητα των Saos 2 κυττάρων με (siRNA-transfected) ή δίχως λουμικάνη (scramblesiRNA-transfected) να προσκολληθούν στην FN (p=NS). Τα αποτελέσματα αυτά προτείνουν μια αντιστρόφως ανάλογη σχέση μεταξύ της έκφρασης της λουμικάνης και της ικανότητας προσκόλλησης των κυττάρων Saos 2 η οποία ρυθμίζεται από την ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού του TGF- β2. Στην συνέχεια, παρατηρήθηκε μια στατιστικά σημαντική αύξηση στην ενεργοποίηση του Smad 2 σηματοδοτικού μορίου στα κύτταρα με ελειπή έκφραση λουμικάνης (p≤0.01) η οποία αναστάλθηκε με την παρουσία αντισωμάτων έναντι του TGF- β2. Το τελευταίο, αποδεικνύει ότι η λουμικάνη αποτελεί ρυθμιστή του σηματοδοτικού άξονα TGF- β2/Smad 2. Επιπρόσθετα, στην διατριβή παρουσιάζονται αποτελέσματα για την έκφραση της β1-ιντεγκρίνης και την ενεργοποίηση της pFAK (εστιακή κινάση προσκόλλησης), που είναι σημαντικά μόρια για την πρόσδεση των κύτταρων στην FN. Συμπερασματικά, η μελέτη περιγράφει ένα καινούριο μηχανισμό σηματοδότησης στα ανθρώπινα κύτταρα οστεοσαρκώματος: η έκκριση της λουμικάνης στον εξωκυττάριο χώρο αποτελεί έναν ενδογενή αναστολέα της δράσης του αυξητικού παράγοντα TGF-β2 και έχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή των μορίων pSmad 2, β1 ιντεγκρίνης και pFAK και την ρύθμιση της προσκολλητικής ικανότητας των κυττάρων του οστεοσάρκωματος (Nikitovic et al., 2011).Στην συνέχεια, μελετήθηκε η επίσης λειτουργικά σημαντική SLRP, διγλυκάνη στα κύτταρα του οστεοσαρκώματος. Η διγλυκάνη συμμετέχει στην ομοιόσταση και στην ανάπτυξη των οστών καθώς και στην παθολογία τους. Η κυτταρική σειρά που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα διατριβή ήταν η MG63. Τα αποτελέσματα αρχικά έδειξαν ότι η διγλυκάνη αυξάνει τον ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων του οστεοσαρκώματος (p≤ 0.001). Στην συνέχεια, ο IGF-I αποδείχτηκε ότι αυξάνει στατιστικά σημαντικά την έκφραση της διγλυκάνης (p≤ 0.01) και αντιθέτως η έλλειψη έκφρασης της διγλυκάνης από τα κύτταρα μείωσε στατιστικά σημαντικά το βασικό αλλά και τον επαγόμενο από τον IGF-I πολλαπλασιασμό των MG63 κυττάρων (p≤ 0.001; p≤ 0.01). Η παραπάνω ρύθμιση του πολλαπλασιασμού ήταν αποτέλεσμα της σηματοδότησης μέσω του υποδοχέα IGF-IR, του οποίου η ενεργοποίηση αυξήθηκε στατιστικά σημαντικά (p≤ 0.01) στα MG63 κύτταρα με ελλιπή έκφραση διγλυκάνης. Η διγλυκάνη έχει δειχθεί σε προηγούμενες μελέτες ότι μπορεί να ρυθμίσει το σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt/β-κατενίνης. Στην παρούσα μελέτη αποδείχτηκε ότι η διγλυκάνη αυξάνει στατιστικά σημαντικά την έκφραση της β-κατενίνης σε πρωτεϊνικό επίπεδο καθώς και τον εντοπισμό της στο κυτταρόπλασμα (p≤ 0.01), την μεμβράνη (p≤ 0.01) και τον πυρήνα των κυττάρων MG63 οστεοσαρκώματος (p≤ 0.05). Μελέτες ανοσοφθορισμού μας έδειξαν ότι η αύξηση της β-κατενίνης οφείλεται στον συν-εντοπισμό της διγλυκάνης και τουWnt συν-υποδοχέα LRP6 (low-density lipoprotein receptor-related protein 6) που έχει ως αποτέλεσμα την μείωση της αποδόμησης της β-κατενίνης, καθώς και συν-εντοπισμό της β-κατενίνης και του ενεργοποιημένου υποδοχέα pIGF-IR στο κυτταρόπλασμα και στην μεμβράνη των MG-63 κυττάρων. Ο συν-εντοπισμός αυτός ήταν ακόμα πιο έντονος μετά την εξωγενή προσθήκη διγλυκάνης. Παράλληλα, η ελλιπή έκφραση της διγλυκάνης μείωσε στατιστικά σημαντικά την βασική αλλά και την επαγόμενη από τον IGF-I ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μορίου ERK1/2, (p≤ 0.001). Συμπερασματικά, η διατριβή αυτή παρουσιάζει δύο καινούριους μηχανισμούς μέσω των οποίων οι SLRPs επηρεάζουν τις κυτταρικές λειτουργίες του οστεοσαρκώματος. Ο πρώτος μηχανισμός αναδεικνύει ότι η διγλυκάνη μέσω του LRP6/β-κάτενινη/IGF-IR σηματοδοτικού άξονα ενισχύει την ικανότητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων του οστεοσαρκώματος (Aggelidakisetal., 2018). Ο δεύτερος μηχανισμός δείχνει ότι η λουμικάνη επηρεάζει την κατάντι σηματοδότηση του TGF β2, συμπεριλαμβανόμενων Smad2/β ιντεγκρίνη/pFAK, στη ρύθμιση της προσκόλλησης των κυττάρων του οστεοσαρκώματος. Οι δύο αυτές SLRPs αποδεικνύεται ότι μπορούν να αποτελούν μόρια στόχους για την ρύθμιση της εξέλιξης των καρκινικών κυττάρων του οστεοσαρκώματος και δημιουργούν τις προϋποθέσεις για μια πιο αποτελεσματική θεραπευτική αντιμετώπιση των όγκων μεσεγχυματικής προέλευσης.