Ανίχνευση προγνωστικών και προβλεπτικών δεικτών σε ασθενείς με χειρουργημένο ορθοκολικό καρκίνο που λαμβάνουν συμπληρωματική χημειοθεραπεία με συνδυασμό φλουροπυριμιδινών και Oxaliplatin

Abstract

Colorectal cancer remains a major cause of cancer mortality in Europe in both men and women. Despite the current high incidence and mortality, both declined the last 40 years in the Western world. Cancer prevention through screening tests and better treatment modalities are thought to be the major factors of this improvement. Furthermore, it was shown that patients with high-risk stage II and stage III colon cancer (CC) who received treatment that adhered to National Comprehensive Cancer Network guidelines had a survival benefit. For stage III disease, combination chemotherapy with a backbone of fluoropyrimidine and oxaliplatin (FOLFOX, CAPOX) is the current standard of care, since it leads to prolongation of both disease-free survival (DFS) and overall survival (OS). The results for addition of Oxaliplatin in OS and DFS for patients with stage II CC with high risk features (such as T4 tumors, obstruction or perforation and vessel invasion) showed a marginal but significant. Despite that, it has long been recognized patients’ individual risk of recurrence varies widely even in patients with same stage in CC. Since today, microsatellite instability (MSI) status is the only biomarker used in daily clinical practice. Project goals and expected results are to investigate specific gene signatures related with increased risk of recurrence and death from the disease, as well as predict and assess response to the “standard adjuvant treatment” of the 5FU combined with LOHP. Secondly, to determine and develop a gene expression profile in proportion with KRAS and BRAF mutational status and likewise with Microsatellite Instability (MSI). Also, to study the expression of genes associated either with the increase of metastatic potential such as NEDD9, PKM2, cMYC or with resistance to LOHP and 5FU such as ERCC1 and TS, respectively, in neoplasm’s that present or not the LKB1 loss of expression or KRAS, BRAF mutations. Finally, to study the genetic mechanism of LKB1 loss (loss of heterozygosity) in sporadic colon cancer.Formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissues from 262 consecutive patients with histologically confirmed stage-II/III CC (group A), 118 metastatic CRC (mCRC) patients treated with oxaliplatin-based chemotherapy (group B) and 104 mCRC patients treated with FOLFIRI (group C), were collected and the mRNA expression levels of the PKM2, ERCC1, cMYC, TS were analyzed by RT-qPCR. In addition, KRAS and BRAF mutations analyzed by Sanger sequencing. Furthermore, the protein expression of LKB1 and MSI status analyzed, only for stage-II/III CC patients. High PKM2 mRNA expression was correlated with left-sided located primaries, high-grade tumors, microsatellite-stable tumors, pericolic lymph nodes involvement and cMYC mRNA expression. High PKM2mRNA expression was correlated with significantly lower Disease Free Survival (DFS) and Overall Survival ingroup-A patients. Similarly, PKM2mRNA expression was associated with significantly decreased Progression Free Survival (PFS) and OS in the group-B. In the contrary, no significant association for the PKM2mRNA expression has been observed with either PFS or OS in group-C. To conclude, the current study provides the evidence for the predictive significance of PKM2mRNA expression oxaliplatin-based treatment resistance, and the findings merits validation in a larger prospective cohort. Last but not least LKB1 expression loss was observed in 117 patients (group A) and correlated with right-sided located primaries, pericolic lymph nodes involvement, BRAFV600E mutations and TS mRNA expression. Patients with LKB1 expression loss experienced significantly lower DFS and OS compared to patients with LKB1expressing tumors. Multivariate analysis revealed LKB1 expression loss as independent prognostic factor for both decreased DFS and decreased OS. Therefore, loss of tumoral LKB1 protein expression constitutes an adverse prognostic factor in patients with operable CC.

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου (ΚΠΕ) είναι παγκοσμίως η 4η σε σειρά εμφάνισης και η τέταρτη σε θνησιμότητα νεοπλασία. Παρ’ όλο που το 50% των ασθενών είναι δυνατόν να θεραπευτεί μόνο με το χειρουργείο, το υπόλοιπο 50% αναπτύσσει μεταστατική νόσο. Ο ρόλος της συμπληρωματικής θεραπείας στον ΚΠΕ σταδίου ΙΙΙ είναι καθιερωμένος μειώνοντας τον κίνδυνο υποτροπής από 19-40% και του θανάτου από 16-33%. Τα τελευταία χρόνια δύο μεγάλες τυχαιοποιημένες μελέτες έχουν αποδείξει ότι η προσθήκη της Oxaliplatin (LOHP) στην «κλασσική θεραπεία» με 5-φλουοροουρακίλη (5-FU) μειώνει περαιτέρω τον κίνδυνο υποτροπής κατά περίπου 25% και συνοδεύεται από μια στατιστικά σημαντική μείωση του κινδύνου θανάτου από τη νόσο σε ασθενείς σταδίου ΙΙΙ. Μέχρι σήμερα δεν έχει αναφερθεί κάποιος μοριακός δείκτης που θα μπορούσε να χρησιμεύσει στον καθορισμό συγκεκριμένων υποομάδων ασθενών που θα μπορούσαν να ωφεληθούν από τη θεραπεία με LOHP. Ελάχιστοι βιοδείκτες είναι διαθέσιμοι για χρήση στην κλινική πρακτική, στους οποίους περιλαμβάνονται τα ογκογονίδια KRAS/BRAF τα οποία προβλέπουν αντίσταση στην αντι-EGFR θεραπεία στον μεταστατικό ΚΠΕ (μΚΠΕ). Επίσης, διάφορες μετα-αναλύσεις κατέδειξαν ότι ασθενείς με μΚΠΕ και BRAF μεταλλάξεις έχουν πολύ χειρότερη πρόγνωση συγκριτικά με τους BRAF-wt. Αντίθετα, ο προγνωστικός ρόλος των BRAF μεταλλάξεων δεν έχει διευκρινιστεί στους ασθενείς με ΚΠΕ σταδίου ΙΙ και ΙΙΙ που υποβάλλονται σε συμπληρωματική χημειοθεραπεία μετά από θεραπευτική εκτομή του όγκου. Πρόσφατα, η Μικροδορυφορική Αστάθεια (MSI) καθιερώθηκε ως ο μόνος μοριακός βιοδείκτης για την χορήγηση ανοσοθεραπείας στον ΚΠΕ, ενώ δεν έχει αναφερθεί κάποιος μοριακός δείκτης που θα μπορούσε να χρησιμεύσει σαν δείκτης ανταπόκρισης κατά τη διάρκεια της θεραπείας (“surrogate marker”). Στόχος του προτεινόμενου ερευνητικού έργου ήταν, α), η διερεύνηση συγκεκριμένων γονιδιακών υπογραφών που σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο υποτροπής και θανάτου καθώς και με αντίσταση στην LOHP και του 5FU, β), να καθορίσει το προφίλ έκφρασης ανάλογα με τις μεταλλαγές των KRAS-BRAF καθώς και με τη μικροδορυφορική αστάθεια (MSI), γ), να μελετηθεί η έκφραση γονιδίων που σχετίζονται είτε με την αύξηση του μεταστατικού δυναμικού (PKM2, NEDD9, cMYC) είτε με αντίσταση στην LOHP και στο 5FU (ERCC1 και TS) και δ) να μελετήσει το γενετικό μηχανισμό απώλειας της LKB1 στον σποραδικό ΚΠΕ.Σε παραφινοποιημένους ιστούς από χειρουργικά παρασκευάσματα 262 ασθενών με χειρουργήσιμο ΚΠΕ, 118 ασθενών με μΚΠΕ (ομάδα επαλήθευσης) πού έλαβαν LOHP και σε 104 ασθενών με μΚΠΕ που δεν έλαβαν LOHP (ομάδα ελέγχου) μελετήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης του mRNA στα γονίδια PKM2, ERCC1, TS, cMYC με qRT-PCR και αναλύθηκαν οι μεταλλάξεις του KRAS (εξώνιο 2) και η V600E του BRAF. Επίσης, στους ασθενείς σταδίου ΙΙΙ ή σταδίου ΙΙ υψηλού κινδύνου αναλύθηκε η πρωτεϊνική έκφραση της LKB1 και η κατάσταση του MSI. Ασθενείς με χειρουργημένο ΚΠΕ και ασθενείς με μΚΠΕ που έλαβαν Οξαλιπλατίνα με υψηλά επίπεδα PKM2 mRNA συσχετίζονται σημαντικά με μικρότερο DFS και OS και μικρότερο PFS και OS, αντίστοιχα. Σε αντίθεση, καμία σημαντική συσχέτιση δεν απεδείχθη στην επιβίωση των ασθενών με μΚΠΕ που δεν έλαβαν Οξαλιπλατίνα. Ομοίως, οι ασθενείς με απώλεια έκφρασης της LKB1 συσχετίζονται σημαντικά με μικρότερο DFS και OS. Επιπλέον, η υπέρ-έκφραση της PKM2 συσχετίστηκε με τους όγκους με μικροδορυφορική σταθερότητα (MSS) και με τους πολύποδες υψηλόβαθμης δυσπλασίας. Οι μεταλλάξεις του BRAF συσχετίστηκαν σημαντικά με την υπέρ-έκφραση της PKM2 και με την απώλεια έκφρασης της LKB1. Τέλος, αναδείχθηκε ισχυρή θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης της PKM2 και του c-MYC και στις τρεις ομάδες ασθενών.Συμπερασματικά, η μελέτη αναδεικνύει την απώλεια της πρωτεϊνικής έκφρασης της LKB1 σαν προγνωστικό βιοδείκτη και την έκφραση mRNA της PKM2 σαν προβλεπτικό βιοδείκτη ευαισθησίας στην Οξαλιπλατίνη, σε ασθενείς που μετά από κολεκτομή λαμβάνουν συμπληρωματική θεραπεία. Ωστόσο, περισσότερες μελέτες απαιτούνται ώστε να επιβεβαιωθούν οι παραπάνω υποθέσεις.