Ανασχεδιασμός της δομής του ενζύμου τρανφεράση της γλουταθειόνης με στόχο την τροποποίηση των καταλυτικών και δομικών του ιδιοτήτων

Abstract

Glutathione transferases are a large superfamily of enzymes involved in the metabolism of xenobiotic compounds. GSTs catalyze the nucleophilic conjugation of the reduced glutathione to a wide variety of electrophilic, hydrophobic and cytotoxic substrates. The reaction product is excreted from the cell, providing a defensive mechanism against the harmful effects of toxic compounds and oxidative stress.In the first part of the thesis, a library of chimeric GSTs created by DNA shuffling of the tau class GSTs from Glycine max were screened using the GSH/alachlor system. Three colonies namely sh4, sh15 and sh19, were selected, cloned, expressed in E. coli and purified. Steady-state kinetic analysis was performed to characterize the enzymes. In addition, the three-dimensional structure of sh4 in complex with GSH was determined at 2.27 Å resolution. The library of the chimeric GSTs was further screened towards thermostability. Three colonies, namely shII5, shII6 and shII7, which showed high stability and enzymatic activity, were selected for further characterization. The results showed that the melting point of the enzymes was increased by about 10 °C. The effect of temperature and pH on enzyme activity and stability were investigated and the thermodynamic parameters were measured. In addition, fluorescence spectroscopy and thermal shift assay were used to characterize the structural and binding properties of the shII5 enzyme. The inhibition of shII5 isoenzyme towards a wide range of pesticides and herbicides was evaluated. The results showed that that strobilurins, are strong inhibitors for the enzyme. Pyrachlostrobin proved to be the strongest inhibitor. In addition, kinetic inhibition studies revealed that pyrachlostrobin appeared to bind at the substrate-binding region in a mixed manner with respect to both substrates, CDNB and GSH. The ability of pyrachlostrobin to inhibit the activity of shII5 enzyme, was exploited for the development of a biosensor for the determination of pyrachlostrobin in water samples. The enzyme was immobilized using glutaraldehyde chemistry in the presence of BSA. The correlation between the different concentrations of pyrachlostrobin and the enzyme activity proved to be linear in a specific range, with correlation coefficient of 99.5%. The repeatability, sensitivity and durability of the GST-biosensor were statistically analysed. In the next part of the thesis, the catalytic diversity of GST isoenzymes from plant and animal sources was investigated. A GST isoenzyme derived from Glycine max was cloned, expressed in E. coli and purified. Also, two GST isoenzymes derived from Phaseolus vulgaris were expressed in E. coli, purified and characterized. The results suggested that the PvGSTU8.1 and PvGSTU8.2 isoenzymes exhibit restricted substrate specificity compared to the GmGSTU5-5 isoenzyme. Steady-state kinetic analysis, using was performed to determine the kinetic parameters towards a range of different electrophile substrates as well as GSH analogues. Two GST isoenzymes from Mus musculus were investigated. The cDNA of the enzymes was isolated using RT-PCR, cloned, expressed in E. coli and purified. Steady-state kinetic analysis was performed to determine the kinetic parameters towards a range of different electrophile substrates. Moreover, the three-dimensional structure of MmGSTP1-1 isoenzyme in complex with S-(4-nitrobenzyl)-GSH was determined at 1.28 Å resolution.

Οι τρανσφεράσες της γλουταθειόνης είναι μια μεγάλη υπεροικογένεια ενζύμων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό ξενοβιοτικών ενώσεων. Kαταλύουν τη διπλή πυρηνόφιλη σύζευξη στην οποία προάγεται η GSH προς όφελος των ηλεκτρονιόφιλων, υδρόφοβων και κυτταροτοξικών υποστρωμάτων. Το προϊόν της αντίδρασης εκκρίνεται από το κύτταρο, παρέχοντας έτσι έναν αμυντικό μηχανισμό έναντι των βλαβερών επιδράσεων των τοξικών ενώσεων και του οξειδωτικού στρες.Όσον αφορά στην πρώτη ενότητα της διατριβής, έπειτα από σάρωση της βιβλιοθήκης μεταλλαγμένων μορφών, επιλέχθηκαν τρεις αποικίες, οι sh4, sh15 και sh19, με βάση την ενζυμική δραστικότητα για το σύστημα GSH/alachlor, οι οποίες αποτέλεσαν μήτρα για την κατευθυνόμενη ενζυμική εξέλιξη. Aυτές κλωνοποιήθηκαν, εκφράστηκαν ετερόλογα και καθαρίστηκαν με χρωματογραφία συγγένειας. Ακολούθησε κινητική ανάλυση για το σύστημα GSH/CDNB όπου και υπολογίστηκαν οι κινητικές σταθερές. Πραγματοποιήθηκε μελέτη της εκλεκτικότητας των ισοενζύμων με διαφορετικά υποστρώματα για να ελεγχθούν πιθανές δράσεις που παρουσιάζουν. Επιπλέον, λύθηκε η κρυσταλλοδομή του ισοενζύμου sh4 με ανάλυση 2,27 Å. Στην προσπάθεια να διευρυνθεί η πολυπλοκότητα, πραγματοποιήθηκε ένας τρίτος κύκλος κατευθυνόμενης ενζυμικής εξέλιξης. Μελετήθηκαν και σε αυτή την περίπτωση τρεις αποικίες, οι shII5, shII6 και shII7. Ακολούθησε η ίδια διαδικασία χαρακτηρισμού των ισοενζύμων. Μελετήθηκε η θερμοδυναμική συμπεριφορά τους και υπολογίστηκε το σημείο τήξεως. Παρατηρήθηκε πως μέσω των επαναλαμβανόμενων κύκλων κατευθυνόμενης ενζυμικής εξέλιξης αυξήθηκε το σημείο τήξεως περίπου κατά 10 ºC. Ακολούθησε σάρωση φυτοπροστατευτικών προϊόντων ως δυνητικών αναστολέων του shII5 και φάνηκε ότι οι στρομπιλουρίνες αναστέλλουν την ενζυμική δραστικότητα του shII5. Έτσι, υπολογίστηκαν οι δείκτες ανασταλτικής ισχύος, όπου το pyrachlostrobin εμφάνισε τη μικρότερη τιμή. Επιπλέον, μελετήθηκε το είδος της αναστολής που επιφέρει το pyrachlostrobin στο ένζυμο μέσω κινητικής μελέτης, όπου φαίνεται να εμφανίζει μικτού τύπου αναστολή έχοντας ως μεταβαλλόμενα υποστρώματα τόσο το CDNB όσο και τη GSH. Τέλος, βασιζόμενοι στην αναστολή που παρουσιάζει το shII5 έναντι του pyrachlostrobin αναπτύχθηκε βιοαισθητήρας ανίχνευσής του σε περιβαλλοντικά δείγματα. Αρχικά το ένζυμο ακινητοποιήθηκε και πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη για το σύστημα GSH/CDNB. Υπολογίστηκε ο δείκτης IC50 για τo pyrachlostrobin με το ακινητοποιημένο ισοένζυμο. Τα αποτελέσματα των φασματοφωτομετρικών μετρήσεων χρησιμοποιώντας το ακινητοποιημένο ενζύμο σε διαφορετικές συγκεντρώσεις pyrachlostrobin έδειξαν ότι η σχέση μεταξύ της συγκέντρωσης του pyrachlostrobin και της παραμένουσας δραστικότητας φαίνεται να είναι γραμμική, για το συγκεκριμένο εύρος τιμών, με R2 99,5%. Η ευαισθησία, της μεθόδου που αναπτύχθηκε, βασίζεται στην ικανότητα που έχει το pyrachlostrobin να αναστέλλει ολοκληρωτικά την ενζυμική του δραστικότητα. Στην επόμενη ενότητα, διερευνήθηκαν GST ισοένζυμα που προέρχονται από φυτικούς και ζωικούς οργανισμούς. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε ισοένζυμο που προέρχεται από τη Glycine max καθώς και δύο ισοένζυμα που προέρχονται από το Phaseolus vulgaris, τα οποία κλωνοποιήθηκαν, εκφράστηκαν σε Ε. Coli και καθαρίστηκαν με χρωματογραφία συγγένειας. Τα αποτελέσματα φανερώνουν ότι τα ισοένζυμα PvGSTU8.1 και PvGSTU8.2 εμφανίζουν περιορισμένη εκλεκτικότητα σε σύγκριση με το ισοένζυμο GmGSTU5-5. Επίσης, πραγματοποιήθηκε κινητική ανάλυση για να προσδιοριστούν οι κινητικές παράμετροι έναντι διαφορετικών ηλεκτρονιόφιλων υποστρωμάτων, καθώς και αναλόγων GSH. Επιπλέον, μελετήθηκαν δύο ισοένζυμα που προέρχονται από Mus musculus. Το cDNA των ενζύμων απομονώθηκε χρησιμοποιώντας RT-PCR, κλωνοποιήθηκε, εκφράστηκε σε Ε. Coli και καθαρίστηκε με χρωματογραφία συγγένειας. Πραγματοποιήθηκε κινητική ανάλυση για να προσδιοριστούν οι κινητικές παράμετροι έναντι διαφορετικών ηλεκτρονιόφιλων υποστρωμάτων. Tέλος, λύθηκε η κρυσταλλοδομή του ισοενζύμου MmGSTP1-1 σε σύμπλεγμα με S-(4-νιτροβενζυλ)-GSH με ανάλυση 1,28 Α.