Απομόνωση βιοδραστικών ενώσεων από σταυρανθή λαχανικά: ταυτοποίηση και ποσοτικός προσδιορισμός με συνθετικές και φασματοσκοπικές τεχνικές

Abstract

Vegetables of the Cruciferae family (order Brassicales) contain a number of organic compounds with biological activity. Among these are glucosinolates, which are found only in the order Brassicales. Upon enzymatic hydrolysis of glucosinolates, aliphatic isothiocyanates, aromatic isothiocyanates and indole derivatives, are released. The isothiocyanate sulforaphane and the indole derivatives, indole-3-carbinol, indole-3-acetonitrile, indole-3-carbaldehyde and ascorbigen were synthesized and used as standards for the developing of new qualitative and quantitative methods applied in cruciferous vegetables. Indole derivatives such as indole-3-acetamide and amide conjugates of indole-3-acetic acid with 10 amino acids were also synthesized. All synthesized compounds were studied by NMR and FT-IR spectroscopy and HRMS. A new method for the direct quantification of total isothiocyanate content of cruciferous vegetables by Fourier Transform Infrared Spectroscopy, using the Attenuated Total Reflection (ATR) technique, in combination with the PLS algorithm, was developed. The assay was based on the absorbance of the 2150-2120 cm-1 region, where the asymmetric stretching of N=C=S appears. The new method proved equivalent to the UV-Vis literature method, based on the F and t statistical tests and the % recovery, which were within the acceptable limits. Subsequently, a new method for the simultaneous determination of sulforaphane and indole-3-carbinol was developed, using a high-resolution mass spectrometer with a Q-TOF mass analyzer. The new UPLC-HRMS/MS method was validated and characterized by excellent linearity and low detection limits. The new UPLC-HRMS/MS method is the first that utilizes high resolution mass spectrometry for the simultaneous determination of sulforaphane and indole-3-carbinol in cruciferous vegetables. Indole-3-carbaldehyde, indole-3-carbinol, indole-3-acetonitrile and ascorbigen, were determined by UHPLC-HRMS/MS. The indole derivatives were studied in extracts of 7 cruciferous vegetables (red and white cabbage, green and purple broccoli, turnip, radish, white cauliflower) through a new UHPLC-HRMS/MS method which was developed for the study. This method is the first application of UHPLC-HRMS/MS for the simultaneous determination of glucobrassicin hydrolysis products in cruciferous vegetables. In the final stage of dissertation, a determination of phytohormones in eight cruciferous vegetables was carried out. The compounds included in the study (27 compounds) were indole-3-acetic acid, 4-chloroindole-3-acetic acid, jasmonic acid and salicylic acid. Indole-3-acetonitrile and indole-3-acetamide and indole-3-carbaldehyde were also studied. Finally, the amide conjugates of indole-3-acetic acid with the amino acids alanine, glycine, tryptophan, serine, methionine, tyrosine, phenylalanine, valine, aspartic acid and glutamic acid were studied. The new UHPLC-HRMS/MS method enabled the identification and quantification of new compounds with unknown role in plants, providing accuracy and reliability of results and can be applied for the study of phytohormones in other plant species.

Τα λαχανικά της οικογένειας των σταυρανθών (τάξη Brassicales) περιέχουν πλήθος βιοδραστικών οργανικών ενώσεων. Μεταξύ αυτών ξεχωρίζουν οι γλυκοζινολίτες οι οποίοι συναντώνται στην τάξη Brassicales. Κατά την ενζυμική υδρόλυση των γλυκοζινολιτών, απελευθερώνονται αλειφατικές ισοθειοκυανικές ενώσεις, αρωματικές ισοθειοκυανικές ενώσεις και παράγωγα του ινδολίου. Στα πλαίσια της διατριβής, συντέθηκαν, η ισοθειοκυανική ένωση σουλφοραφάνη, οι ινδολικές ενώσεις ινδολο-3-καρβινόλη, ινδολο-3-ακετονιτρίλιο, ινδολο-3-καρβαλδεΰδη και ασκορβιγόνο. Επίσης, συντέθηκαν τα ινδολικά παράγωγα, ινδολο-3-ακεταμίδιο και τα αμιδικά συζεύγματα του ινδολο-3-οξικού οξέος με 10 αμινοξέα. Όλες οι ενώσεις που συντέθηκαν, μελετήθηκαν με φασματοσκοπία NMR και FT-IR και φασματομετρία μάζας HRMS. Αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος άμεσου ποσοτικού προσδιορισμού του συνόλου των ισοθειοκυανικών ενώσεων στα σταυρανθή λαχανικά, με φασματοσκοπία υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier, αξιοποιώντας την τεχνική της εξασθενημένης ολικής ανάκλασης (ATR FT-IR), σε συνδυασμό με τον αλγόριθμο PLS. Ο ποσοτικός προσδιορισμός βασίστηκε στις απορροφήσεις της περιοχής 2150-2120 cm-1 όπου εμφανίζεται η ασύμμετρη τάση N=C=S. Η νέα μέθοδος αποδείχθηκε ισοδύναμη με την αντίστοιχη μέθοδο UV-Vis της βιβλιογραφίας, βάση των στατιστικών ελέγχων F και t και της % ανάκτησης, που ήταν εντός των αποδεκτών ορίων. Στη συνέχεια της διατριβής, αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος ποιοτικού και ποσοτικού προσδιορισμού της σουλφοραφάνης και της ινδολο-3-καρβινόλης, χρησιμοποιώντας φασματογράφο μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας με αναλυτή μαζών Q-TOF. Η νέα μέθοδος UPLC-HRMS/MS επικυρώθηκε και χαρακτηρίστηκε από εξαιρετική γραμμικότητα και χαμηλά όρια ανίχνευσης. Επιπλέον, προσδιορίστηκαν με UΗPLC-HRMS/MS οι ενώσεις, ινδολο-3-καρβαλδεΰδη, ινδολο-3-καρβινόλη, ινδολο-3-ακετονιτρίλιο και ασκορβιγόνο. Η συγκριμένη μέθοδος αποτελεί την πρώτη εφαρμογή του UHPLC-HRMS/MS για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό των προϊόντων ενζυμικής υδρόλυσης της γλυκομπρασικίνης σε σταυρανθή λαχανικά. Στο τελευταίο στάδιο της διατριβής πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός των φυτορμονών με UΗPLC-HRMS/MS σε οχτώ σταυρανθή λαχανικά. Οι ενώσεις που συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη (27 ενώσεις) ήταν οι φυτορμόνες, ινδολο-3-οξικό οξύ, 4-χλωροϊνδολο-3-οξικό οξύ, ιασμονικό οξύ και σαλικυλικό οξύ. Επίσης προσδιορίστηκαν, το ινδολο-3-ακετονιτρίλιο, το ινδολο-3-ακεταμίδιο και η ινδολο-3-καρβαλδεΰδη. Τέλος, προσδιορίστηκαν στοχευμένα τα αμιδικά συζεύγματα του ινδολο-3-οξικού οξέος με τα αμινοξέα αλανίνη, γλυκίνη, θρυπτοφάνη, σερίνη, μεθειονίνη, τυροσίνη, φαινυλαλανίνη, βαλίνη, ασπαρτικό οξύ και γλουταμινικό οξύ. Η νέα μέθοδος UΗPLC-HRMS/MS που αναπτύχθηκε, επέτρεψε την ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση νέων ενώσεων, που δεν είναι γνωστός ο ρόλος τους στα φυτά, παρέχοντας ακρίβεια και αξιοπιστία των αποτελεσμάτων και μπορεί να εφαρμοστεί για την μελέτη των φυτορμονών και σε άλλα είδη φυτών.