Ανάπτυξη in vitro συστημάτων καλλιεργειών δενδριτικών κυττάρων για την αντιγονοπαρουσίαση τεχνητών αντιγόνων σε Τ κύτταρα ασθενών με σκλήρυνση κατά πλάκας με απώτερο σκοπό τη δημιουργία θεραπευτικών εμβολίων

Abstract

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease which affects the central nervous system and its pathogenetic mechanism is orchestrated mostly by autoreactive T and B cells which escaped the mechanisms of immunological tolerance. The induction of immunological tolerance through the action of dendritic cells is a new-introduced strategy for the treatment of MS. The aim of this dissertation is the generation and the study of antigen presentation of the mannan congugated peptide MOG35-55 by tolerogenic dendritic cells (tolDCs), which present the peptide to T cells in order to induce tolerance. In our experimental protocol, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from healthy individuals and patients with RR-MS. PBMCs were differentiated in several types of DCs in the presence of IL-4 and GM-CSF, with or without the addition of dexamethasone(DEXA), vitamin D3(VitD3) or the combination DEXA+VitD3. On day 6 of culture, DCs were loaded with the peptide or mannan only and received the LPS maturation signal. On day 8, DCs were co-cultured with autologous PBMCs in the presence of IL-2 for 3 or 4 antigen-presentation circles. The phenotypes of DCs and T cell populations were analyzed using flow cytometry. The cytokine secretion profiles of DCs and T cells were determined with Cytometric Bead Arrays for the following cytokines: IL-1β/IL-2/IL-4/IL-6/IL-8/IL-10/IL-12p70/IL-17A/TNF-α/IFN-γ and ELISA for TGF-β1.The study and analysis of DCs on day 8 revealed that tolDCs had the lower surface expression of CD80 and CD86 molecules and higher IL-10 compared to mature DCs, and this allowed the phenotypic and functional separation between mature and tolerogenic DCs. The co-cultures of PBMCs with the different types of DCs, after 3 or 4 antigen presentation circles, promoted the generation of memory of CD4 but not of CD8 T cells. From the estimation of activation levels of CD4 T cells, we observed an inhibition of activation in the co-cultures with tolDCs which presented the peptide. These results were followed by a simultaneous increase in the percentages of exhausted CD4+PD-1+ and regulatory CD4+CD25highFoxP3+ Τ cells and the secretion of IL-10 or/and TGF-β1. These results suggest that the peptide loaded tolDCs, which we generated in vitro, induce tolerance on T cells and can be used as a therapeutic vaccine for MS.

Η σκλήρυνση κατά πλάκας (ή πολλαπλή σκλήρυνση, ΠΣ) είναι μια αυτοάνοση νόσος που προσβάλει το κεντρικό νευρικό σύστημα και o παθογενετικός μηχανισμός της ενορχηστρώνεται κυρίως από αυτοαντιδρώντα Τ και Β κύτταρα τα οποία έχουν ξεφύγει από την επιτήρηση του μηχανισμού της ανοσολογικής ανοχής. Η επαγωγή της ανοχής μέσω δενδριτικών κυττάρων (DCs) είναι μία νέα στρατηγική για τη θεραπεία της. Σκοπός της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν η δημιουργία και η μελέτη ενός συστήματος αντιγονοπαρουσίασης του πεπτιδίου MOG35-55 συζευγμένο με μαννάνη από ανοσοανεκτικά δενδριτικά κύτταρα (tolDCs), τα οποία παρουσιάζουν το πεπτίδιο και επάγουν την ανοχή των Τ κύτταρων. Στο πειραματικό πρωτόκολλο που αναπτύξαμε, απομονώθηκαν περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος (PBMCs), από υγιείς δότες και ασθενείς με RR-MS, και τα οποία διαφοροποιήθηκαν σε διάφορους τύπους DCs υπό την επίδραση IL-4 και GM-CSF, παρουσία δεξαμεθαζόνης(DEXA) ή βιταμίνης D3(VitD3) ή και των δύο. Την 6η ημέρα της καλλιέργειας τους τα DCs «φορτώθηκαν» με το πεπτίδιο ή τη μαννάνη και έλαβαν το σήμα ωρίμανσής τους μέσω του LPS. Την 8η ημέρα συνκαλλιεργήθηκαν με αυτόλογα PBMCs παρουσία IL-2 για 3 ή 4 κύκλους αντιγονοπαρουσίασης. Ο φαινότυπος των DCs και των T-κυτταρικών πληθυσμών προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα κυτταροκινικά προφίλ των DC και των Τ-κυττάρων αποτελούμενα από τις κυτταροκίνες: IL-1β/IL-2/IL-4/IL-6/IL-8/IL-10/IL-12p70/IL-17A/TNF-α/IFN-γ, μετρήθηκαν με Cytometric Bead Array και ο TGF-β1 με ELISA.Η μελέτη και η ανάλυση των DCs την 8η ημέρα της καλλιέργειάς τους έδειξε ότι η χαμηλότερη επιφανειακή έκφραση των μορίων CD80 και CD86 και η μεγαλύτερη παραγωγή IL-10 από τα tolDCs σε σύγκριση με τα ώριμα DCs μας επιτρέπει το σαφή φαινοτυπικό και λειτουργικό διαχωρισμό μεταξύ ώριμων και ανοσοανεκτικών DCs.Οι συνκαλλιέργειες των PBMCs με τα διάφορα είδη DCs, μετά από 3 ή 4 κύκλους αντιγονοπαρουσίασης, προήγαγαν τη δημιουργία μνήμης στα CD4 και όχι στα CD8 T κύτταρα. Από τον προσδιορισμό των επίπεδων ενεργοποίησης των CD4 T κυττάρων παρατηρήθηκε καταστολή της ενεργοποίησής τους στις συνκαλλιέργειες με τα tolDCs που αντιγονοπαρουσίασαν το πεπτίδιο. Παράλληλα, παρατηρήσαμε αύξηση των ποσοστών των εξαντλημένων CD4+PD-1+ και των ρυθμιστικών CD4+CD25highFoxP3+ Τ κυττάρων και την έκκριση IL-10 ή και TGF-β1. Τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι τα tolDCs που αναπτύξαμε in vitro επάγουν την ανοχή στα Τ κύτταρα και θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σαν θεραπευτικό εμβόλιο για την ΠΣ.