Διερεύνηση των επιπτώσεων της ακτινοβολίας κινητού τηλεφώνου στη μνήμη και μάθηση μυών Mus musculus

Abstract

It is the first time in human history that such a small device potentially harmful, but very flexible and user-friendly has gained an unprecedented popularity at all levels of society in all countries, all ages up to teenagers. The handheld mobile devices that act as transmitters of electromagnetic radiation (EMR) began their expansion in the 70's. Scientific research that is currently implemented on the biological effects and health effects has enormous accumulation of more than 3000 published articles, half of them after 2007. Because of global concern about the possible harmful effects of mobile phoneson health current research applies several different approaches, including epidemiological, clinical, experimental laboratory animals, cell cultures and isolated molecules (proteins, enzymes, DNA). A small part of the research has focused on published behavioral approaches, controlling learning and mnemonic damage caused by the influence of electromagnetic radiation at the frequencies of mobile phones, but using mostly as a radiation source RF generators and rodent model system. One of the pioneering studies was by Henry Lai and colleagues at the University of Chicago, who showed 20 years ago that exposingrats to pulsed, circularly polarized waves (2.450 MHz, with an average specific absorption rate SAR equal to 0.6 W/kg i.e. less than the "safe"limit of 1,6 W/kg caused changes in cholinergic brain functions, especially in the hippocampus by affecting memory and learning in animals. The results of this first survey a decade later challenged by other research groups, then a series of contradictory results appeared in the literature related to the effects of EMR on learning functions of laboratory animals. The aim of the thesis was to reveal potential cumulative and transient damage to mice memory, caused by long-term daily 90-minute exposure to EMR from mobile phone at specific absorption rate value relatively low (0,22 W/kg), using two most widely used behavioral tests ORT-Object Recognition Task and OLT-Object Location Task implemented in an experimental model of Musmusculus. Basic knowledge of neurobiology of mice memory suggests that specific regions of the brain are responsible for specific functions of memory: parahippocampal and entorhinal structures associated with recognition memory and hippocampus structures involved in spatial memory. It is known that the Object Recognition Task-ORT is a useful tool for investigating failures of "non-spatial recognition memory" inrodents and for this reason it has been widely used in pharmacological studies of hippocampal - entorhinal lesions. Another type of behavioral testing referred to in hippocampus dependent spatial memory performance is the Object Location Task -OLT, devised to test memory dysfunction in the elderly. The OLT was first applied to rats and requires the participation of the hippocampus CA1 region and the dentate gyrus, which plays an important role in the function of spatial memory. Both assays ORT and OLT are based on the spontaneous tendency of rodents to explore objects generally, as it has been observed to explore longer a new object against a familiar object and adisplaced against a non-displaced. To answer the questions raised in this thesis was to investigate by behavioral approaches the effects of EMR on memory function, namely: is there a cumulative effect (short& long-term exposure to EMR)? Is there a difference in the effect ofradiation on the spatial and non-spatial memory? May be recovery effects on memory take place when irradiation is stopped? Has EMR an effect on memory after intermittent (every other day) exposure? Αre changes in memory associated with ultrastructural alterations in the hippocampus?. In order to answer these questions three experimental protocols were designed and implemented in the specially constructed "Animal Facilities Unit" of the Department of Cell Biology and Biophysics with three groups of male mice aged 5 weeks from 8 animals each, comprising of the exposure group, the sham exposed group and the control group. The mobile phone operating in speaking emission was placed under the cage housing the mice (4 mice per cage). The experimental protocol 1 lasted 34 days with daily irradiation for 90 minutes a day. The three tests of ORT lasted 3 days each and were applied to all mice, at the start of irradiation, 17 days later and at the end. A gradual decrease was found in the performance of non-spatial memory.The experimental protocol 2, which lasted for 66 days, was designed for a comparative evaluation of the two types of memory (spatial and non-spatial) applying a specially designed 5-day ORT & OLT protocol. Relevant trials were implemented at the beginning, after 1 month and at the end of irradiation. It was found that both types of memory are vulnerable to the effects of radiation, but with a greater statistically significant difference the spatial memory. After the 66 days tissues were obtained for morphological analysis by electron microscopy of hippocampus. Deterioration of cohesion was found on the fine structure of cells which may explain the disturbances in the functioning of the memory controlled by the hippocampus The experimental protocol 3, which lasted for 148 days, was designed to test whether memory function can be restored after cessation of 50 days irradiation. It was found that even 12 days after stopping EMR exposure of mice recovery was observed which was complete 1 month later. The same experimental protocol was applied intermittently, every other day irradiation without any significant effect on the performance of spatial and non-spatial memory, suggesting that during the interval of 46 hours of non-irradiation, repair mechanisms are activated The innovation of this study was that for the first time in search of electromagnetic fields examined the effect of electromagnetic radiation at a particular stage of the process of mnemonic operation (consolidation phase), and also that for the first time two different behavioral tests were applied to the same series of animals in order to evaluate and correlate the performance of the two types of memorythrough different combinations of long-term exposure, lack of exposure and intermittent exposure protocols. More over the case of recovery of the two types of memory was examined after cessation of irradiation for specific time intervals. Specifically, a) conventional mobile phone used in normal conversation, in mice, b) the reversibility of the effects of memory after cessation of exposure to radiation wastested suggesting that lesions off set by repair mechanisms (antioxidant enzymes or activation of neurogenesis). At the conclusion echoes the observation that intermittent, every other day irradiation caused no disruption to the performance of spatial and non-spatial memory. Lastly, the disturbance of the coherence of fine structure of cells of the hippocampus after 66 days of daily irradiation was observed by Electron Microscopy. In summary it is proposed along with the findings of other studies that exposure of mice to cell phone radiation for 90 minutes a day disrupts the oxidative potential thus prevent the antioxidant mechanisms to reverse the damage causing continuous dysfunction of proteins, synaptogenesis, and apoptosis of cells. This situation prevents the storage and consolidation of information of the shape and the position of the objects offered during the ORT and OLT tests, but with continued deterioration and recovery - restore the molecules to their original working condition as long as interruption of radiation takes place. It is under investigation the probability of reversibility aftersome critical "amount" of irradiation and detection by immunohistochemistry and immunoblotting of specific proteins that undergo changes (qualitative or quantitative) as a result of mobile phone radiation exposure.

Είναι η πρώτη φορά στην ανθρώπινη ιστορία, που μια τόσο μικρή συσκευή δυνητικά επιβλαβής, αλλά πολύ ευέλικτη και φιλική προς το χρήστη έχει αποκτήσει μια τόσο πρωτοφανή δημοτικότητα σε όλα τα κοινωνικά επίπεδα, σε όλες τις χώρες, όλες τις ηλικίες μέχρι και στους εφήβους. Οι φορητές συσκευές κινητών τηλεφώνων που λειτουργούν ως πομποί ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας (ΗΜΑ) ξεκίνησαν την ιλιγγιώδη εξάπλωση τους στη δεκαετία του 70. Η επιστημονική έρευνα που εφαρμόζεται σήμερα σχετικά με τις βιολογικές επιδράσεις και τις επιπτώσεις στην υγεία παρουσιάζει τεράστια συσσώρευση με περισσότερα από 3000 δημοσιευμένα άρθρα, τα μισά από αυτά μετά από το 2007. Εξαιτίας της παγκόσμιας ανησυχίας σχετικά με τις πιθανές βλαβερές επιπτώσεις των κινητών τηλεφώνων στην υγεία η τρέχουσα έρευνα εφαρμόζει πολλές διαφορετικές προσεγγίσεις, όπως επιδημιολογικές,κλινικές, πειραματικές σε ζώα εργαστηρίου, σε καλλιέργειες κυττάρων και σε μεμονωμένα μόρια (πρωτεΐνες, ένζυμα, DNA) . Ένα μικρό μέρος της έρευνας που έχει δημοσιευθεί εστιάζεται σε συμπεριφορικές προσεγγίσεις, που ελέγχουν μαθησιακές και μνημονικές βλάβες, που προκαλούνται από την επίδραση της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας στις συχνότητες της κινητής τηλεφωνίας χρησιμοποιώντας κυρίως γεννήτριες ραδιοσυχνοτήτων ως πηγή ακτινοβολίας και τρωκτικά ως πρότυπο σύστημα.Μια από τις πρωτοποριακές μελέτες ήταν του Henry Lai και συνεργατών στο Πανεπιστήμιο του Σικάγο, που έδειξε 20 χρόνια πριν ότι η έκθεση των αρουραίων σε παλμικά, κυκλικά πολωμένα ραδιοκύματα(2.450 MHz, με μέσο ρυθμό ειδικής απορρόφησης SAR ίσο με 0.6 W/kg δηλαδή μικρότερο από το «ασφαλές» όριο των 1,6 W/kg που ισχύει διεθνώς) προκάλεσε αλλαγές στις χολινεργικές λειτουργίες του εγκεφάλου και ειδικά στον ιππόκαμπο επηρεάζοντας τη μνήμη και τη μάθηση των ζώων. Τα αποτελέσματα αυτής της πρώτης έρευνας αμφισβητήθηκαν μια δεκαετία αργότερα από άλλες ερευνητικές ομάδες, όπου στη συνέχεια μια σειρά από αντιφατικά αποτελέσματα εμφανίστηκαν στη βιβλιογραφία, που σχετίζονταν με τις επιδράσεις της ΗΜΑ στις μαθησιακές λειτουργίες ζώων εργαστηρίου.Ο στόχος της Διδακτορικής Διατριβής ήταν να αποκαλύψει πιθανές συσσωρευτικές και παροδικές βλάβες στη μνήμη μυών, που προκαλούνται από μακράς διάρκειας καθημερινή 90λεπτη έκθεση σε ΗΜΑ κινητού τηλεφώνου με τιμή ρυθμού ειδικής απορρόφησης σχετικά μικρή (0,22 W/kg), με τη χρήση των δυο πλέον διαδεδομένων συμπεριφορικών δοκιμασιών ORT- Object Recognition Task και OLT-Object Location Task που εφαρμόστηκαν στο πειραματικό πρότυπο Mus musculus. Οι βασικές γνώσεις νευροβιολογίας που αφορούν τη μνήμη μυών υποδεικνύουν ότι συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου είναι υπεύθυνες για συγκεκριμένες λειτουργίες της μνήμης: παραϊπποκάμπειες και ενδορρινικές δομές σχετίζονται με τη μνήμη αναγνώρισης, ενώ ιπποκάμπειες δομές εμπλέκονται στη χωρική μνήμη.Είναι γνωστό ότι η «Δοκιμασία Αναγνώρισης Αντικειμένου» (ObjectRecognition Task-ORT) αποτελεί χρήσιμο εργαλείο για τη διερεύνηση βλαβών της «μη χωρικής μνήμης αναγνώρισης» σε τρωκτικά και για το λόγο αυτό έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως σε φαρμακολογικές μελέτες ιπποκάμπειων – ενδορρινικών αλλοιώσεων.Άλλος ένας τύπος συμπεριφορικής δοκιμασίας που αναφέρεται σε ιππόκαμπο-εξαρτώμενη επίδοση χωρικής μνήμης είναι η «Δοκιμασία Αναγνώρισης Θέσης Αντικειμένου» (Object Location Task - OLT), που επινοήθηκε για να ελέγξει δυσλειτουργίες της μνήμης σε ηλικιωμένους.Η δοκιμασία OLT πρώτη φορά εφαρμόστηκε σε αρουραίους και απαιτεί τη συμμετοχή της ιπποκάμπειας CA1 περιοχής και της οδοντωτής έλικας, η οποία κατέχει σημαντικό ρόλο στη λειτουργία της χωρικής μνήμης. Και οι δυο δοκιμασίες ORT και OLT βασίζονται στην αυθόρμητη τάση των τρωκτικών για εξερεύνηση αντικειμένων γενικότερα, καθώς έχει παρατηρηθεί ότι εξερευνούν για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα ένα νέο αντικείμενο έναντι ενός γνώριμου και ένα μετατοπισμένο αντικείμενο έναντι ενός μη μετατοπισμένου.Για να απαντηθούν τα ερωτήματα που τέθηκαν στη διατριβή αυτή έγινε διερεύνηση με συμπεριφορικές προσεγγίσεις της επίδρασης της ΗΜΑ στη λειτουργία της μνήμης και συγκεκριμένα: Υπάρχει συσσωρευτική επίδραση (σύντομη & χρόνια έκθεση σε ΗΜΑ); Υπάρχει διαφορά στην επίδραση της ακτινοβολίας ως προς τη χωρική και τη μη χωρική μνήμη; Μπορεί να γίνει ανάκαμψη των επιπτώσεων στη μνήμη όταν διακοπεί η ακτινοβόληση; Έχει επίδραση στη μνήμη η διακοπτόμενη (μέρα παρά μέρα) έκθεση; Επίσης διερευνήθηκε εάν οι αλλαγές στη μνήμη σχετίζονται με υπερμικροσκοπικές αλλαγές στον ιππόκαμπο. Για τους σκοπούς αυτούς σχεδιάστηκαν και εφαρμόστηκαν τρία πειραματικά πρωτόκολλα στην ειδικά κατασκευασμένη «Μονάδα Ζωικών Προτύπων» του Τομέα Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής με τρεις ομάδες αρσενικών μυών ηλικίας 5 εβδομάδων από 8 ζώα η καθεμία, που αποτελούσαν την ομάδα ακτινοβόλησης, εικονικής έκθεσης και μαρτύρων. Το κινητό τηλέφωνο σε ομιλούσα εκπομπή είχε τοποθετηθεί κάτω από τον κλωβό στέγασης των μυών (4 μύες ανά κλωβό):Το πειραματικό πρωτόκολλο 1 διήρκεσε 34 ημέρες με καθημερινή ακτινοβόληση για 90 λεπτά την ημέρα. Οι τρεις δοκιμασίεςORT διάρκειας 3 ημερών η καθεμία εφαρμόστηκαν σε όλους τους μυς κατά την έναρξη της ακτινοβόλησης, 17 ημέρες μετά και στο τέλος.Διαπιστώθηκε σταδιακή μείωση της επίδοσης της μη χωρικής μνήμης. Το πειραματικό πρωτόκολλο 2 που διήρκεσε 66 ημέρες Το πειραματικό πρωτόκολλο 1 διήρκεσε 34 ημέρες με καθημερινή ακτινοβόληση για 90 λεπτά την ημέρα. Οι τρεις δοκιμασίες ORT διάρκειας 3 ημερών η καθεμία εφαρμόστηκαν σε όλους τους μυς κατά την έναρξη της ακτινοβόλησης, 17 ημέρες μετά και στο τέλος.Διαπιστώθηκε σταδιακή μείωση της επίδοσης της μη χωρικής μνήμης Το πειραματικό πρωτόκολλο 2 που διήρκεσε 66 ημέρες σχεδιάστηκε για να γίνει συγκριτική αποτίμηση των δυο ειδών μνήμης(χωρική και μη χωρική) εφαρμόζοντας ειδικά σχεδιασμένο 5νθήμερο πρωτόκολλο ORT&OLT. Οι σχετικές δοκιμασίες εφαρμόστηκαν στην αρχή, μετά από 1 μήνα και στο τέλος της περιόδου ακτινοβόλησης. Διαπιστώθηκε πως τόσο η χωρική μνήμη όσο και η μη χωρική μνήμη αναγνώρισης είναι ευάλωτη στην επίδραση της ακτινοβολίας, αλλά με μεγαλύτερη στατιστικά σημαντική διαφορά για τη χωρική μνήμη. Μετά το πέρας των 66 ημερών έγινε λήψη ιστών για μορφολογική ανάλυση ιππόκαμπου με ηλεκτρονική μικροσκοπία. Διαπιστώθηκε αλλοίωση της συνοχής της λεπτής δομής των κυττάρων κάτι που ίσως εξηγεί τις διαταραχές στη λειτουργία της μνήμης που ελέγχεται από τον ιππόκαμπο. Το πειραματικό πρωτόκολλο 3 που διήρκεσε 148 ημέρες,σχεδιάστηκε για να ελεγχθεί κατά πόσο μπορεί να επανέλθει η λειτουργία της μνήμης μετά από ακτινοβόληση 50 ημερών όταν γίνει διακοπή της. Διαπιστώθηκε πως ακόμη και 12 ημέρες μετά τη διακοπή υπήρξε ανάκαμψη η οποία ολοκληρώθηκε 1 μήνα αργότερα. Στο ίδιο πειραματικό πρωτόκολλο εφαρμόστηκε διακοπτόμενη, ημέρα παρά ημέρα ακτινοβόληση χωρίς καμιά στατιστικά σημαντική επίδραση στην επίδοση χωρικής και μη χωρικής μνήμης, που υποδηλώνει πως κατά το μεσοδιάστημα των 46 περίπου ωρών μη ακτινοβόλησης, λειτουργούν επανορθωτικοί μηχανισμοί.Η καινοτομία της συγκεκριμένης μελέτης ήταν ότι για πρώτη φορά στην έρευνα των ηλεκτρομαγνητικών πεδίων εξετάζεται η επίδραση της Ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας σε συγκεκριμένο στάδιο της διαδικασίας της μνημονικής λειτουργίας (φάση παγίωσης), καθώς επίσης και ότι για πρώτη φορά δυο διαφορετικές συμπεριφορικές δοκιμασίες εφαρμόζονται στη σειρά στους ίδιους μυς με στόχο να αξιολογηθούν και να συσχετιστούν η επίδοση των δύων τύπων μνήμης μέσω διαφορετικών συνδυασμών μακράς διάρκειας έκθεσης, απουσίας έκθεσης και διακοπτόμενης έκθεσης πρωτοκόλλων. Επιπλέον εξετάστηκε η περίπτωση ανάκαμψης των δύων τύπων μνήμης μετά από διακοπή της ακτινοβόλησης για συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα. Συγκεκριμένα,α) χρησιμοποιήθηκε συμβατικό κινητό τηλέφωνο σε συνθήκες κανονικής συνομιλίας, σε ποντίκια β) ελέγχθηκε η αντιστρεπτότητα των επιπτώσεων της μνήμης μετά τη διακοπή της έκθεσης στην ακτινοβολία υποδηλώνοντας πως οι βλάβες αντισταθμίζονται με επιδιορθωτικούς μηχανισμούς (αντιοξειδωτικά ένζυμα ή ενεργοποίηση νευρογένεσης). Προς το συμπέρασμα αυτό συμφωνεί και η παρατήρηση πως διακοπτόμενη, ημέρα παρά ημέρα ακτινοβόληση δεν προκάλεσε διαταραχές στην επίδοση της χωρικής και της μη χωρικής μνήμης. Τέλος, διαπιστώθηκε διαταραχή της συνοχής της λεπτής δομής των κυττάρων του Ιππόκαμπου μετά από 66 ημερών καθημερινή ακτινοβόληση.• Προτείνεται σε συνδυασμό και με πορίσματα άλλων μελετών πως η έκθεση των μυών στην ακτινοβολία κινητού τηλεφώνου για 90’ ημερησίως διαταράσσει το οξειδωτικό δυναμικό με αποτέλεσμα να μην είναι σε θέση οι αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί να αντιστρέψουν τις βλάβες προκαλώντας συνεχή δυσλειτουργία πρωτεϊνών, συνάψεων,ίσως και απόπτωση κυττάρων. Η κατάσταση αυτή παρεμποδίζει την αποθήκευση και παγίωση των πληροφοριών μορφής και θέσης αντικειμένων που προσφέρονται κατά τις δοκιμασίες ORT και OLT, με συνεχή επιδείνωση, αλλά και με ανάκαμψη – επαναφορά τωνμορίων στην αρχική τους λειτουργική κατάσταση εφόσον γίνει διακοπή της ακτινοβολίας. Είναι υπό διερεύνηση η πιθανότητα μη αντιστρεπτότητας μετά από κάποια κρίσιμη «ποσότητα» ακτινοβόλησης, αλλά και η ανίχνευση με ανοσοιστοχημεία και ανοσοστυπώματος των συγκεκριμένων πρωτεϊνών που υφίστανται αλλαγές (ποιοτικές ή ποσοτικές) εξ αιτίας της ακτινοβόλησης.