Μελέτη του φυσιολογικού ρόλου της 4-υδροξυλάσης της προλίνης κατά την ωρίμανση του καρπού της τομάτας

Abstract

Plant prolyl 4 hydroxylases catalyze proline hydroxylation of Arabinogalactan proteins (AGPs), extensions and hydroxyproline rich proteins. Therefore, the frequency of glycosylation is dependent on the frequency of hydroxylation indicating the importance of P4Hs for their proper structure and function. However, there are few reports investigating the physiological significance of P4Hs in tomato growth and development. Towards that direction a number of transgenic lines produced by silencing and overexpression of both Ρ4H3 ( P4H3-35S::RNAi and P4H3-35S::cDNA c.v. Ailsa-Craig) driven by the constitute prompter 35S. The down regulation of mRNA:P4H3 in 9 independent transgenic lines carrying the 35S::Ρ4H3-RNAi resulting a number of phenotypes with agronomic significance: I) Fruits with smaller size (~30%) due to alteration in cell enlargement. Microscope analysis revealed a significant reduction in the final cell area caused by a significant reduction in cell enlargement. II) A reduction by 80% the number of seeds number per fruit III) Seeds with altered morphology containing shorter embryos exhibiting also differences in germination rate, IV) Alterations in the physiological parameters of fruit ripening such as softening, V) Alterations in climacteric ethylene production rate, IV) Alteration in carotenoids consecrations and more specifically lycopene and β-carotene and The higher carotenoid levels may be the result of the higher expression levels of the genes involved in the carotnoids biosynthetic pathway as the Carotene isomerase L (CrtISO L) that was determined by qRT-PCR. On top of that microarray analysis was performed to determine the expression analysis and for the investigation of the P4H regulators and their interacting proteins by LeMoNe algorithm in four fruit ripening stages that yielded the identification of 2 transcriptional factors (ERF24 and bHLH54) regulating a significant number of genes. Moreover, only one P4H was found to be differentially expressed during fruit ripening, the P4H4. Besides that, a notable phenotype was the alteration in anther and fruit abscission time. It was monitored that in all 9 indented transformed lines there was a delay in fruit abscission in over ripe fruits comparing with over ripe w.t. fruits. These alterations in programmed fruit abscission are highly associated with the tensile strength experiments in red ripe fruits, that showed that RNAi fruits required greater force (N) and more time (sec.) for the abscission zone to break due to greater elongation percentage (%) compared to the w.t. due to the greater tensile strength required, as a result of lower expression levels of cell wall hydroxylases such as polygalacturonases, cellulases and b-galactosidases. The level of those genes expression was determined by qRT-PCR. Those alterations were explained to the lower cell number of the transgenic lines RNAi #7, #6 and #1 which were analyzed. The main goal of this work was to study the potential function of P4H3 in tomato fruit, by altering the expression of P4H3 gene. The results yielded a great number of phenotypes with significant agronomic importance, as the increase in carotenoids levels, and improvement in softening that can be used in the future the improvement of tomato fruit quality.

Οι P4Hs ανήκουν στην οικογένεια των 2-οξογλουταρικό-εξαρτώμενων διοξυγενασών και για το σχηματισμό υδροξυπρολίνης απαιτούνται 2-οξογλουταρικό οξύ και Ο2 ως συνυποστρώματα, Fe²+ ως συμπαράγοντας και ασκορβικό οξύ για μέγιστη ενεργότητα (Kivirikko και Myllyharju, 1998). Στα φυτά, ο ρόλος των P4Hs έχει διερευνηθεί κυρίως με την κατασκευή και το χαρακτηρισμό μεταλλάξεων στο γένομα της αραβίδοψης (Hieta και Myllyharju, 2002) στο γαρύφαλλο (Vlad et.al., 2010) στην πράσινη άλγη Chlamydomonas reinhardtii (Keskiaho et al., 2007) και την τομάτα (Fragkostefanakis et al., 2014). Παρά την μεγάλη τους σημασία στην δομή και λειτουργία του κυτταρικού τοιχώματος των φυτών, λίγα έχουν γίνει για τον προσδιορισμό της φυσιολογικής τους σημασίας στα φυτά και πιο συγκεκριμένα στον καρπό της τομάτας. Προς αυτήν την κατεύθυνση, δημιουργήθηκαν σταθερές γενετικά τροποποιημένες σειρές φυτών μέσο της επιμόλυνσης κοτυληδόνων με Agrobacteriun t., χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της ιστοκαλλιέργειας. Ειδικότερα χρησιμοποιήθηκε ο φορέας 35S::P4H3-RNAi όπου μέσω του μηχανισμού της RNAi γονιδιακής σίγησης προκάλεσε την μείωση της έκφρασης ενός γονιδίου P4H στην ποικιλία τομάτας c.v. Ailsa Craig,. Από την άλλη χρησιμοποιήθηκε η κασέτα 35S:: P4H3 cDNA όπου με την καθοδήγηση του ίδιου προωθητή (35S) προκάλεσε την υπερ-έκφραση ενός γονιδίου P4H. Πιο συγκεκριμένα η μείωση της έκφρασης του Ρ4H3 mRNA σε 9 ανεξάρτητες σειρές φυτών προκάλεσε: I) καρπούς μικρότερης διαμέτρου κατά ~30%, II) μείωση κατά 80% στον αριθμό των σπόρων ανά καρπό, III) σπόροι διαφορετικής μορφολογίας με έμβρυα μικρότερου μήκους και διαφορές στην φυτρωτική τους ικανότητα, ΙV) μεταβολή στα επίπεδα έκκρισης του κλιμακτηρικού αιθυλενίου, V) αύξηση στη συγκέντρωση των καροτενοειδών αλλά και VI) στην συνοχή της σάρκας. Για τον προσδιορισμό της έκκρισης του κλιμακτηρικού αιθυλενίου έγιναν μετρήσεις στους καρπούς με τη χρήση αέριου χρωματογράφου στήλης (GC) καθόλη την πορεία ωρίμανσής τους ξεκινώντας από το στάδιο του μεταχρωματισμού έως το στάδιο του ώριμου κόκκινου. Ο προσδιορισμός των καροτενοειδών έγινε κυρίως από καρπούς που ήταν στο στάδιο του ώριμου κόκκινου (RR) χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο υπεριώδους-ορατού και συνοχή της σάρκας προσδιορίστηκε με τη χρήση μηχανικού αναλυτή μεγάλων παραμορφώσεων (Texture Analyze- TA-XT2i) Από τις αναλύσεις αυτές βρέθηκε ότι από το βιοσυνθετικό μονοπάτι του αιθυλενίου η σημαντικότερη μεταβολή εντοπίζεται σε μία συνθάση του αιθυλενίου κατά τα στάδια του TU, PK και RR. Από το βιοσυνθετικό μονοπάτι των καροτενοειδών βρέθηκε ότι η ισομεράση carotene isomerase (ΖΙCO) παρουσιάζει σημαντική αύξηση κυρίως κατά το στάδιο της αλλαγής χρώματος (TU), ενώ από τις αναλύσεις των γονιδίων που εμπλέκονται στη συνοχή της σάρκας βρέθηκε ότι η πολυγαρακτουρονάση (PG) αυξάνεται κατακόρυφα στο στάδιο του μεταχρωματισμού (BR). Η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης τριών AGPs γονιδίων έδειξε ότι η έκφραση τους είχε μειωθεί στατιστικά σημαντικά και στα τρία εξεταζόμενα γονίδια κυρίως στο στάδιο του TU και PK, επαληθεύοντας έτσι τη θεωρία περί εμπλοκής των PH4s στην λειτουργία των AGPs (Fragkstefanakis et al, 2014; Vlad et al., 2007; Kivirikko et al, 1998).Εκτός από τις δομικές και φυσιολογικές αλλαγές που προκλήθηκαν, παρατηρήθηκαν και σημαντικές μεταβολές στο πρόγραμμα αποκοπής του καρπού και άνθους όπου παρατηρήθηκε ότι και στις 9 RNAi-P4H3 ανεξάρτητες σειρές, υπήρξε μία καθυστέρηση της διαδικασίας αποκοπής σε υπερώριμους καρπούς σε σχέση με τους φυσιολογικούς καρπούς (WT). Οι συγκεκριμένες αλλαγές στο πρόγραμμα αποκοπής προφανώς συνδέονται με την δύναμη εφελκυσμού της ζώνης αποκοπής σε καρπούς στο στάδιο του ώριμου καρπού (RR) όπου σύμφωνα με τις μελέτες αποκοπής, απαιτήθηκε μεγαλύτερη δύναμη (Newton) και περισσότερος χρόνος λόγω της μεγαλύτερης ελαστικότητας (Elongation percentage %) για την σχίση της ζώνης αποκοπής του καρπού. Τέλος, Από την ανάλυση των μικροσυστοιχιών ταυτοποιήθηκαν δύο μεταγραφικοί παράγοντες (ERF24 και bHLH54) οι οποίοι παρουσίασαν σημαντική διαφορά έκφρασης (fold change) μεταξύ της σειράς RNAi-P4H3 και του μάρτυρα στο χρονικό διάστημα ωρίμανσης μεταξύ Br+10, Br+30 και Br+90. Ο κύριος σκοπός της εργασίας που ήταν η αλλαγή της έκφρασης μίας P4H στην τομάτα ολοκληρώθηκε επιτυχώς, ενώ δημιουργήθηκε μία σειρά από γενετικά τροποποιημένους καρπούς με αρκετά διαφορετικά μορφολογικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά.