Μοριακή και φυλογενετική ανάλυση στελεχών μυκοβακτηριδίου της φυματίωσης στη Βόρεια Ελλάδα και έλεγχος της ανθεκτικότητάς τους στα αντιφυματικά φάρμακα

Abstract

The study of tuberculosis is currently subject of intense research, because it continues to be a major public health problem worldwide, despite the availability of effective antituberculosis drugs and methods for its detection. The World Health Organization estimates that in 2015 there were approximately 10.4 million new TB cases and about 1.6 million deaths.In Greece, approximately 600 cases of tuberculosis per year are reported, while in 2014, was registered a slight reduction of declared cases as well as in the incidence of the disease in comparison with previous years. Nevertheless, the entry of immigrants from countries with high TB incidence and the insufficiency in the reference procedure lead to further underestimation of the prevalence of the disease while facilitating its further spread.In recent years, the emergency of resistant strains of Mycobacterium is of important concern and its treatment requires expensive as well as time consuming regimens. It is estimated that globally 5% of TB cases have multi-drug resistance (MDR-TB) in the main anti-TB drugs isoniazid and rifampin and that 9% of multiresistant forms are characterized by extensive-drug resistance (XDR-TB). The existence of MDR-TB and XDR-TB cases in our country is also of high concern, growing since 1990, after the massive entry of economic immigrants and political refugees from countries with high incidence of the disease.In the present study have been conducted the phylogenetic analysis of M.tuberculosis strains isolated from patients in Macedonia-Thrace region, North Greece, using the spoligotyping method in order to determine the epidemiological association between these strains and their origin. At the same time, resistant strains were analysed, using both conventional phenotypic and molecular methods for the detection of mutations that are linked to the resistance to first line anti-TB drugs isoniazid and rifampicin.The results demonstrated that 2 out of the 37 new Mtb strains were MDR, while 4 were isoniazid mono-resistant. M.tuberculosis families were distributed as follows: 27% (n=10) Haarlem lineage, 24,3% (n=9) T lineage, 13,5% (n=5) Beijing lineage, 5,4% (n=2) Latin-America and Mediterranean (LAM lineage) and 2,7% (n=1) in S lineage. The remaining 10 strains 27% (n=10) did not belong to any known lineage. The present study suggets that there is no predominant lineage in North Greece. Moreover, no statistically significant relationship was found either between the lineages’ type and sex (p = 0,868) or origin of the patients (p = 0,540). Additionally, the type of the lineage and resistance to the two major anti-TB drugs, was not statistically significant (p = 0,567).The present study describes for the first time, the genetic diversity of M. tuberculosis in the region of Northern Greece and determines the possible associations with both transmission and susceptibility to first line drugs. The results of this recearch can contribute actively in local tuberculosis surveillance programs, as set by the World Health Organization and the European Centre for Disease Prevention and Control of Diseases (ECDC), to control the spread of the disease.

Η μελέτη της φυματίωσης αποτελεί αντικείμενο εντατικής έρευνας, καθώς παρά την αποτελεσματικότητα των αντιφυματικών φαρμάκων και των διαθέσιμων διαγνωστικών μεθόδων, η συγκεκριμένη νόσος εξακολουθεί να αποτελεί σοβαρό πρόβλημα της δημόσιας υγείας παγκοσμίως. Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας εκτιμά ότι το 2015 υπήρξαν περίπου 10,4 εκατομμύρια νέα κρούσματα φυματίωσης και περίπου 1,6 εκατομμύρια άνθρωποι έχασαν τη ζωή τους. Στη χώρα μας, δηλώνονται περίπου 600 κρούσματα φυματίωσης ετησίως, ενώ από τo 2014, παρατηρήθηκε μικρή πτωτική τάση των δηλούμενων κρουσμάτων και της επίπτωσης της νόσου σε σύγκριση με τα προηγούμενα έτη. Παρόλα αυτά, εξακολουθεί να υπάρχει αθρόα είσοδος μεταναστών από χώρες με υψηλή επίπτωση φυματίωσης καθώς και υποδήλωση της νόσου. Αυτοί οι παράγοντες οδηγούν σε υποεκτίμηση του επιπολασμού της νόσου, διευκολύνοντας την εξάπλωση της. Τα τελευταία χρόνια, ανησυχία προκαλεί η εμφάνιση πολυανθεκτικών και εκτενώς ανθεκτικών στελεχών του μυκοβακτηριδίου, η θεραπεία των οποίων απαιτεί ακριβά και χρονοβόρα θεραπευτικά σχήματα. Εκτιμάται ότι το 5% των κρουσμάτων φυματίωσης παγκοσμίως παρουσιάζουν πολυανθεκτικότητα (MDR-TB), δηλαδή αντοχή στα αντιφυματικά φάρμακα ισονιαζίδη και ριφαμπικίνη, ενώ το 9% των πολυανθεκτικών μορφών χαρακτηρίζονται από εκτενώς ανθεκτική φυματίωση (XDR-TB). Η πολυανθεκτική φυματίωση είναι υπαρκτό πρόβλημα και στη χώρα μας, διαρκώς αυξανόμενο, μετά την αθρόα είσοδο οικονομικών μεταναστών και πολιτικών προσφύγων, από χώρες με υψηλό επιπολασμό της νόσου, χωρίς να γίνεται ο απαραίτητος έλεγχος υγείας κατά την άφιξη τους στην Ελλάδα. Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε φυλογενετική ανάλυση των μυκοβακτηριδιακών στελεχών που απομονώθηκαν από ασθενείς που νοσηλεύτηκαν στη Bόρεια Ελλάδα (Μακεδονία και Θράκη), με τη χρήση της μεθόδου των σπολιγότυπων (spoligotyping), με σκοπό την επιδημιολογική συσχέτιση των στελεχών, καθώς και τη διερεύνηση της προέλευση τους. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε έλεγχος της ανθεκτικότητας των στελεχών του μικροοργανισμού με τις συμβατικές φαινοτυπικές μεθόδους και με τη μοριακή ανίχνευση των μεταλλάξεων, οι οποίες συσχετίζονται με την αντοχή των στελεχών στα αντιφυματικά φάρμακα. Από τα 37 νέα στελέχη του μυκοβακτηριδίου της φυματίωσης, επιβεβαιωμένα με στερεή καλλιέργεια, 2 μόνο ήταν ανθεκτικά και στην ισονιαζίδη και στη ριφαμπικίνη (MDR στελέχη), ενώ 4 ήταν μόνο-ανθεκτικά στην ισονιαζίδη. Σύμφωνα με την παρούσα μελέτη δεν επικρατεί κάποια συγκεκριμένη φυλογενετική οικογένεια (lineage) στη Βόρεια Ελλάδα. Από τα 37 στελέχη που τυποποιήθηκαν, το 27% (n=10) ανήκε στη φυλογενετική οικογένεια Haarlem, το 24,3% (n=9) στη T, το 13,5% (n=5) στη Beijing, το 5,4% (n=2) στη Latin-America and Mediterranean (LAM) και το 2,7% (n=1) στην S οικογένεια. Τα υπόλοιπα 10 στελέχη 27% ήταν ”ορφανά”, δηλαδή δεν ανήκαν σε κάποια γνωστή φυλογενετική οικογένεια. Επιπλέον, από τη μελέτη δεν προέκυψε κάποια στατιστικώς σημαντική σχέση μεταξύ των στελεχών που τυποποιήθηκαν (σπολιγοτύπων) και του φύλου των ασθενών (p = 0,868) ή την καταγωγή τους (p = 0,540). Τέλος, η συσχέτιση μεταξύ των φυλογενετικών οικογενειών και της αντοχής στα δύο κύρια αντιφυματικά φάρμακα πρώτης γραμμής, δεν ήταν στατιστικώς σημαντική (p = 0,567) και συμβαδίζει με τα διεθνή βιβλιογραφικά δεδομένα. Η παρούσα μελέτη περιγράφει, για πρώτη φορά, τη γενετική ποικιλομορφία του M. tuberculosis στη Βόρεια Ελλάδα. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής θα συνεισφέρουν ενεργά τόσο στον έλεγχο της εξάπλωσης της φυματίωσης, όσο και στη μελέτη της επιδημιολογίας της νόσου.