Mycobacterium tuberculosis: αντοχή στα αντιφυματικά και διερεύνηση της αντοχής

Abstract

Mycobacterium tuberculosis is an immobile, obligate aerobic, acid-fast bacillus and belongs to the high G+C Gram-positive bacteria. It is the causative agent of tuberculosis, which is one of the major public health problems with high morbidity and mortality worldwide. A recent report by the World Health Organization (WHO) estimated 10.0 million new cases and 1.6 million deaths from TB in 2017 from tuberculosis. Its treatment is long and consists of two phases. The initial phase includes rifampicin (RIF), isoniazid (INH), pyrazinamide (PZA), ethambutol (EMB) as first-line anti-tuberculosis agents. Streptomycin (STR) is a second-line drugs, however, it is still incorporated into first-line regimens. In recent years, the increasing prevalence of drugs resistant tuberculosis (DR-TB), especially multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB, resistant to both INH and RIF) and extensively drug-resistant tuberculosis (XDR-TB, resistant to isoniazid and rifampin, plus any fluoroquinolone and at least one of second-line drugs, amikacin or kanamycin or capreomycin) is a major problem. The immediate treatment is extremely important not only for the successful outcome of the patient but also for the reduction of the spread of the M. tuberculosis in the environment. Unfortunately, the generation time of the mycobacterium is long and that is why its isolation and its drug susceptibility testing are time consuming. The molecular techniques play important roles in both the direct detection of the M. tuberculosis in the clinical sample and the detection of the main mutations associated with resistance. The aim of this study was to determine the resistance rate of M. tuberculosis strains, isolated from patients in Thessaly, the characterization of mutations associated with drug resistance and to investigate the polymorphisms for epidemiological studies.M. tuberculosis Complex (MTBC) isolates were isolated from patients in the Microbiological Laboratory of the University General Hospital of Larissa during 2009-2017. Isolation and identification of strains were done by phenotypic methods and molecular methods. Subsequently, drug susceptibility testing for first- and second-line TB drugs was performed using the reference method BACTEC MGIT 960, the microdilution method (Sensititre) and the E-test method. Two molecular genotyping methods were used, MST and MIRU-VNTR. At the same time, mutations in genes associated with drug resistance to tuberculosis were detected and were differentiated from polymorphisms.Out of the 265 MTBC isolates, 37 (13.96%) were resistant to TB drugs, of which 31 were identified as M. tuberculosis/M. canettii and 6 as M. bovis. None of MTBC stains were MDR and XDR. Resistance rates of M. tuberculosis / M. canettii strains were 6% in STR, 5.2% in INH, 1.5% in PZA, 1.1% in EMB and 0.4% in RIF. All M. bovis strains were resistant only to PZA. Additional, 17 susceptible strains of M. tuberculosis / M. canettii were randomly selected for further characterization. Most of the stains were isolated from male patients, Greeks over 60 and foreigners between 20-40 years old. Based on the MIRU-VNTR method, the most prevalent genotype was Haarlem (33.3%), following the genotypes S-type (16.7%), Beijing (12.5%), X-type (4.2%), CAS / Delhi (2.1%), LAM (2, 1%), Tur (2.1%). Thirteen isolates were unclassified (27%). Based on the MST method, the strains classified into known MST groups: ST6 (20.8%), ST13 (14.6%), ST3 (12.5%), ST23 (10.4%), ST26 (8.3%), ST4 (6.3%), ST42 (2.1%), ST77 (2.1%), and into new ST profiles: ST81 (2.1%), ST85 (2.1%), ST86 (2.1 %), ST87 (2.1%), ST88 (4.2%), ST89 (4.2%), ST90 (2.1%), ST91 (2.1%), ST92 (2.1%). There was no correlation between ST profiles and the resistance mutation patterns. The combination of two methods detected that the dominant lineage was the Euro-American. New and known mutations associated with anti-tuberculosis drug resistance identified. Mutations associated with resistance to isoniazid (katG, inhA, mabA genes and in promoter region of inhA and ahpC genes) were detected in 85.7% of isolates. An interesting finding was that a small percentage of INH-resistant strains carried the most common mutations S315T and c-15t, while new or fewer common ones were detected in them. STR-resistant strains carried 81.25% mutations in the rpsL and gidB genes. Phylogenetic polymorphisms of fourteen genes were found during molecular analysis and were associated with specific ST types, MIRU-VNTR families as well as M. bovis strains. This study reveals the complexity of the mechanisms of M. tuberculosis drug resistant strains.

Το Mycobacterium tuberculosis είναι ένα Gram θετικό βακτηρίδιο, οξεάντοχο και αλκαλοάντοχο, υποχρεωτικά αερόβιο, ακίνητο, με υψηλή περιεκτικότητα σε G+C. Είναι ο αιτιολογικός παράγοντας της φυματίωσης, η οποία αποτελεί ένα από τα μεγαλύτερα προβλήματα δημόσιας υγείας με υψηλή νοσηρότητα και θνησιμότητα παγκοσμίως. Η πιο πρόσφατη έκθεση (2017) του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (Π.Ο.Υ.) εκτιμά 10 εκατομμύρια νέα κρούσματα και 1,6 εκατομμύρια θάνατοι από φυματίωση. Η θεραπεία της είναι μεγάλης διάρκειας και αποτελείται από δύο φάσεις. Η αρχική φάση περιλαμβάνει ριφαμπικίνη (RIF), ισονιαζίδη (INH), πυραζιναμίδη (PZA), αιθαμβουτόλη (EMB) ως αντι-φυματικούς παράγοντες πρώτης γραμμής. Η στρεπτομυκίνη (STR) ανήκει στα φάρμακα δεύτερης γραμμής, ωστόσο, εξακολουθεί να ενσωματώνεται σε θεραπευτικά σχήματα πρώτης γραμμή. Τα τελευταία χρόνια, ο αυξανόμενος επιπολασμός της ανθεκτικής φυματίωσης (DR-TB), ειδικότερα της πολυανθεκτικής φυματίωσης (MDR-TB, ταυτόχρονη αντοχή σε INH και RIF) ή της εκτεταμένης αντοχής (ταυτόχρονη αντοχή σε INH και RIF με συνοδό αντοχή σε μία κινολόνη και σε ένα δευτερεύον αντιφυματικό, ή αμικασίνη, ή καπρεομυκίνη ή καναμυκίνη) αποτελεί μείζον πρόβλημα. Η άμεση εφαρμογή της αντιφυματικής θεραπείας είναι εξαιρετικά σημαντική όχι μόνο για την επιτυχή έκβαση της πορείας του ασθενούς άλλα και για τον περιορισμό της διασποράς του μικροοργανισμού στο περιβάλλον. Δυστυχώς ο χρόνος γενεάς του μυκοβακτηριδίου είναι μεγάλος και γι’ αυτό η απομόνωση του και κατά συνέπεια ο έλεγχος ευαισθησίας του στα αντιφυματικά είναι εξαιρετικά χρονοβόρος. Η εφαρμογή των μοριακών τεχνικών βοήθησε σημαντικά τόσο στην ταχεία ανίχνευση του μικροοργανισμού απευθείας στο κλινικό δείγμα όσο και στην ανίχνευση των κυριότερων μεταλλάξεων που σχετίζονται με αντοχή. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν ο προσδιορισμός του ποσοστού αντοχής των στελεχών M. tuberculosis, που απομονώθηκαν από ασθενείς στην περιοχή της Θεσσαλίας, ο χαρακτηρισμός των μεταλλάξεων που σχετίζονται με την έκφραση αντοχής και η διερεύνηση της ύπαρξης πολυμορφισμών για επιδημιολογικές μελέτες. Τα στελέχη M. tuberculosis Complex (MTBC) που μελετήθηκαν απομονώθηκαν στο Μικροβιολογικό Εργαστήριο του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Λάρισας (ΠΓΝΛ) από νοσηλευμένους ασθενείς την περίοδο 2009-2017. Η απομόνωση και ταυτοποίηση των στελεχών έγινε με φαινοτυπικές μεθόδους και με μοριακές μεθόδους. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε έλεγχος ευαισθησίας στα αντιφυματικά φάρμακα πρώτης και δεύτερης γραμμής με τη μέθοδο αναφοράς σε υγρό θρεπτικό υλικό MGIT 960, με την μέθοδο μικροαραιώσεων σε υγρό μέσο καλλιέργειας Middlebrook 7H10 και με τη μέθοδο E-test. Η μοριακή τυποποίηση βασίστηκε στις μοριακές μεθόδους γονοτύπησης MST και MIRU-VNTR. Παράλληλα, ελέγχθηκαν για πιθανές μεταλλάξεις 35 γονίδια σχετιζόμενα με αντοχή στα αντιφυματικά φάρμακα και ακολούθησε διάκριση των μεταλλάξεων από τους πολυμορφισμούς. Από τα 265 απομονωμένα στελέχη MTBC, τα 37 (13,96%) ήταν ανθεκτικά στα αντιφυματικά φάρμακα, εκ των οποίων τα 31 ήταν M.tuberculosis/M. canettii και τα 6 M. bovis. O έλεγχος ευαισθησίας δεν ανέδειξε MDR-TB και XDR-TB στελέχη. Τα ποσοστά αντοχής των M. tuberculosis/ M. canettii ανήλθαν σε 6% στη STR, 5,2% στη INH, 1,5% στην PZA, 1,1% στην EMB και 0,4% στη RIF, ενώ τα M. bovis ήταν όλα ανθεκτικά μόνο στην PZA. Για περαιτέρω χαρακτηρισμό επιλέχθηκαν τυχαία επιπλέον 17 ευαίσθητα στελέχη M. tuberculosis/ M. canettii. Η πλειοψηφία των στελεχών απομονώθηκε από άντρες ασθενείς, Έλληνες άνω των 60 και αλλοδαπών μεταξύ 20-40ετών. Βάση της μεθόδου MIRU-VNTR, τα στελέχη ανήκαν στις οικογένειες Haarlem (33,3%). Τα εναπομείναντα στελέχη χαρακτηρίστηκαν από τους ακόλουθους γονοτύπους S-type (16,7%), Beijing (12,5%), X-type (4,2%), CAS/Delhi (2,1%), LAM (2,1%), Tur (2,1%), και δεκατρία στελέχη αταξινόμητα (unclassified) (27%). Βάση της μεθόδου MST, τα στελέχη διανέμονταν σε γνωστούς κλωνικούς τύπους ST6 (20,8%), ST13 (14,6%), ST3 (12,5%), ST23 (10,4%) , ST26 (8,3%), ST4 (6,3%), ST42 (2,1%), ST77 (2,1%), ST81 (2,1%), και σε νέους ST85 (2,1%), ST86 (2,1%), ST87 (2,1%), ST88 (4,2%), ST89 (4,2%), ST90 (2,1%), ST91(2,1%), ST92 (2,1%). Δεν υπήρξε συσχέτιση μεταξύ των προφίλ ST και της αντοχής στα αντιφυματικά. Από τη συσχέτιση των δυο μεθόδων προέκυψε ως κυρίαρχη η γενεολογία Euro-American (lineage 4). Ο μοριακός έλεγχος των γονιδίων ανέδειξε γνωστές άλλα και νέες μεταλλάξεις που προσδίδουν αντοχή στα υπό μελέτη αντιφυματικά φάρμακα. Οι μεταλλάξεις (γονίδια katG, inhA, mabA και στους υποκινητές των γονιδίων inhA και ahpC) σχετιζόμενες με αντοχή στην INH εντοπίστηκαν σε ποσοστό 85,7% των στελεχών. Ενδιαφέρον εύρημα ήταν ότι μικρό ποσοστό των INH-ανθεκτικών στελεχών έφεραν τις πιο κοινές μεταλλάξεις S315T και c-15t, ενώ νέες ή λιγότερο συχνές ανιχνεύθηκαν σε αυτά. Τα στελέχη με αντοχή στην STR έφεραν μεταλλάξεις στα γονίδια rpsL και gidB σε ποσοστό 81,25%. Φυλογενετικοί πολυμορφισμοί βρέθηκαν σε δεκατέσσαρα γονίδια κατά τη μοριακή ανάλυση και σχετίστηκαν με συγκεκριμένους ST τύπους, οικογένειες MIRU-VNTR καθώς και με στελέχη M. bovis. Η μελέτη αυτή αποκαλύπτει την πολυπλοκότητα της εξέλιξης των μηχανισμών αντοχής στα αντιφυματικών φαρμάκων των στελεχών M. tuberculosis.