Περίληψη
Η Προθυμοσίνη α (ΠροΤα) αποτελεί ένα εξελικτικά συντηρημένο πολυπεπτίδιο των θηλαστικών (μήκους 109 αμινοξέων στον άνθρωπο), το οποίο εμφανίζει πλειοτροπική ανοσοενισχυτική δράση. Το αμινο(Ν)-τελικό θραύσμα [1-28] του μορίου, το οποίο ταυτίζεται με το ανοσοενισχυτικό πεπτίδιο Θυμοσίνη α1 (Τα1) θεωρήθηκε αρχικά ως η ανοσοδραστική περιοχή του πολυπεπτιδίου. Πρόσφατα όμως δεδομένα υποστηρίζουν ότι η ΠροΤα ασκεί μια διακριτή ανοσοεπαγωγική δράση μέσω του καρβοξυ(C)-τελικού της θραύσματος [100-109] ή της κεντρικής περιοχής [51-89], στοχεύοντας τον υποδοχέα τύπου Toll 4 (Toll Like Receptor 4, TLR4). Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής,αναπτύχθηκε ένα εξειδικευμένο παράγωγο της C-τελικής περιοχής ΠροΤα [100-109](ΠροΤα-D1), ικανό να ραδιοεπισημανθεί με τεχνήτιο-99m (99m Tc). Η ανοσοδραστικότητα του συμπλόκου του νέου παραγώγου με μη ραδιενεργό ρήνιο (185/187Re) ([185/187Re]ΠροΤαD1),δομικά όμοιο με το [99m Tc]ΠροΤα-D1, αξιολογήθηκε in vitro σε κατάλληλη ανοσοδοκιμασία και σε δοκιμασία κινητικής ...
Η Προθυμοσίνη α (ΠροΤα) αποτελεί ένα εξελικτικά συντηρημένο πολυπεπτίδιο των θηλαστικών (μήκους 109 αμινοξέων στον άνθρωπο), το οποίο εμφανίζει πλειοτροπική ανοσοενισχυτική δράση. Το αμινο(Ν)-τελικό θραύσμα [1-28] του μορίου, το οποίο ταυτίζεται με το ανοσοενισχυτικό πεπτίδιο Θυμοσίνη α1 (Τα1) θεωρήθηκε αρχικά ως η ανοσοδραστική περιοχή του πολυπεπτιδίου. Πρόσφατα όμως δεδομένα υποστηρίζουν ότι η ΠροΤα ασκεί μια διακριτή ανοσοεπαγωγική δράση μέσω του καρβοξυ(C)-τελικού της θραύσματος [100-109] ή της κεντρικής περιοχής [51-89], στοχεύοντας τον υποδοχέα τύπου Toll 4 (Toll Like Receptor 4, TLR4). Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής,αναπτύχθηκε ένα εξειδικευμένο παράγωγο της C-τελικής περιοχής ΠροΤα [100-109](ΠροΤα-D1), ικανό να ραδιοεπισημανθεί με τεχνήτιο-99m (99m Tc). Η ανοσοδραστικότητα του συμπλόκου του νέου παραγώγου με μη ραδιενεργό ρήνιο (185/187Re) ([185/187Re]ΠροΤαD1),δομικά όμοιο με το [99m Tc]ΠροΤα-D1, αξιολογήθηκε in vitro σε κατάλληλη ανοσοδοκιμασία και σε δοκιμασία κινητικής μελέτης της επιφανειακής έκφρασης του υποδοχέα TLR4 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα, συγκριτικά πάντα με την αντίστοιχη δραστικότητα του ακέραιου μορίου της ΠροΤα, διαφόρων πεπτιδικών ΠροΤα-παραγώγων αλλά και κατάλληλων αρνητικών μαρτύρων. Μελέτες κυτταρικής δέσμευσης που ακολούθησαν αποκάλυψαν εξειδικευμένη πρόσδεση του παραγώγου [99m Tc]ΠροΤα-D1 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα, η οποία είναι χρονο-εξαρτώμενη, υπόκειται σε κορεσμό και αναστέλλεται από την παρουσία του ακέραιου μορίου της ΠροΤα, του θραύσματος ΠροΤα[100-109] και του λιποπολυσακχαρίτη LPS, αλλά όχι από την Τα1, το κεντρικό θραύσμα ΠροΤα[51-89] και τους αρνητικούς μάρτυρες. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν την ύπαρξη ειδικών θέσεων πρόσδεσης της ΠροΤα σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα, οι οποίες αναγνωρίζουν την C-τελική περιοχή ΠροΤα[100-109] και πιθανότατα εμπλέκουν τον υποδοχέα TLR4. Χάρη στις ιδιότητες του ραδιοϊσοτόπου που χρησιμοποιήθηκε για την επισήμανση του παραγώγου, το σύμπλοκο [99m Tc]ΠροΤα-D1 αξιολογήθηκε περαιτέρω σε in vivo μελέτες βιοκατανομής και απεικόνισης σε μοντέλο φλεγμονής σε ποντίκια. Οι μελέτες αυτές έδωσαν σημαντικές πληροφορίες φαρμακοκινητικής φύσεως αλλά κυρίως κατέδειξαν την ικανότητα του [99m Tc]ΠροΤα-D1 για εκλεκτική στόχευση εστιών φλεγμονής. Η στρατολόγηση του [99m Tc]ΠροΤα-D1 σε τόπους φλεγμονής, με βάση και τα αποτελέσματα κατάλληλου αρνητικού μάρτυρα, είναι ειδική και οφείλεται στην παρουσία της C-τελικής περιοχής ΠροΤα[100-109]. Συνολικά, η παρούσα διατριβή συνέβαλλε στη συλλογή σημαντικών πληροφοριών για την αποσαφήνιση του εξωκυτταρικού ρόλου της ΠροΤα, οι οποίες θα διευκολύνουν την πιθανή μελλοντική αξιοποίηση του πολυπεπτιδίου ή και του μικρότερου C-τελικού δεκαπεπτιδίου ΠροΤα[100-109] στην κλινική πράξη.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
Prothymosin alpha (ProTα) is a conserved mammalian polypeptide (human sequence 109amino acid-long) exerting a pleiotropic immunoenhancing activity. The N-terminal fragment[1-28] of the molecule, which is identical with the immunostimulating peptide thymosin α1(Tα1), was earlier considered as the immunoactive region of the polypeptide; however,recent data suggest that ProTα may exert a discrete immunomodulating action through itsC-terminal decapeptide [100-109] or its central region [51-89], via targeting Toll-likereceptor- 4 (TLR4). In the frame of this work, a derivative of the C-terminal fragmentProTα[100-109] (ProTα-D1) that can be radiolabeled with 99mTc was developed. Thebiological activity of the non-radioactive 185/187rhenium-complex of this derivative([Re]ProTα-D1, structurally similar with [99mTc]ProTα-D1) was evaluated in suitable in vitrobioassays and in assays correlated with TLR4 surface expression using humanneutrophils, in comparison with intact ProTα, various synthetic ...
Prothymosin alpha (ProTα) is a conserved mammalian polypeptide (human sequence 109amino acid-long) exerting a pleiotropic immunoenhancing activity. The N-terminal fragment[1-28] of the molecule, which is identical with the immunostimulating peptide thymosin α1(Tα1), was earlier considered as the immunoactive region of the polypeptide; however,recent data suggest that ProTα may exert a discrete immunomodulating action through itsC-terminal decapeptide [100-109] or its central region [51-89], via targeting Toll-likereceptor- 4 (TLR4). In the frame of this work, a derivative of the C-terminal fragmentProTα[100-109] (ProTα-D1) that can be radiolabeled with 99mTc was developed. Thebiological activity of the non-radioactive 185/187rhenium-complex of this derivative([Re]ProTα-D1, structurally similar with [99mTc]ProTα-D1) was evaluated in suitable in vitrobioassays and in assays correlated with TLR4 surface expression using humanneutrophils, in comparison with intact ProTα, various synthetic ProTα fragments/derivatives and negative control peptides. Subsequent cell-binding studies revealed specific, time-dependent and saturable binding of [99mTc]ProTα-D1 on neutrophils, which was inhibited by intact ProTα and the synthetic ProTα[100-109], as well as by a “prototype” TLR4-ligand (lipopolysaccharide from Escherichia coli, LPS), but not by synthetic Τα1, the central ProTα region and negative control peptides. Our results support the existence of ProTα-binding sites on human neutrophils, recognizing the C-terminal region [100-109], which might involve TLR4. Due to the properties of the radioisotope used for the labeling, [99mTc]ProTα-D1 was further evaluated in in vivo biodistribution and whole body imaging studies in mice bearing an inflammation model. These studies provided important information related to the pharmacokinetic profile of [99mTc]ProTα-D1 but above all revealed the capacity of [99mTc]ProTα-D1 to selectively target inflammatory loci in vivo.The accumulation of [99mTc]ProTα-D1 in inflammatory sites is specific and due to thepresence of the C-terminal decapeptide ProTα[100-109]. Overall, the present thesissignificantly contributed to the enrichment of our basic knowledge on the extracellularmode of action of ProTα, both in vitro and in vivo. Additionally, such data will facilitatefuture exploitation of the polypeptide or a smaller active fragment thereof, such as ProTα[100-109], in the clinical setting.
περισσότερα