Απομόνωση και χαρακτηρισμός γονιδίων παραγωγής θερμοφιλίνης του γαλακτικού βακτηρίου Streptococcus thermophilus

Abstract

Streptococcus thermophilus is a Gram-positive bacterium, facultative anaerobe, non pathogenic, alpha hemolytic and member of the Streptococcus viridans group. It belongs to the thermophilic lactic acid bacteria (L.A.B.) and is considered safe to consume (Generally Recognized As Safe, G.R.A.S.). It is used widely as a starter culture for the production of dairy products and is considered the second most important organism in the dairy industry. The strain S. thermophilus ACA-DC 0040 from the Agriculture University of Athens microorganism collection produces the bacteriocin thermophilin T, the production of which seems to be related to the growth rate of the organism and is the topic of this study.Initially the growth of ACA-DC 0040 strain was tested with a series of growth mediums in relation to bacteriocin production, genetic material purification and competence in transformation experiments and the mediums were selected by case. Based on deposited DNA sequences of other S. thermophilus strains, a corresponding blp locus, possibly related to thermophilin T production, was found, cloned and sequenced. This genetic locus consists of 13092 base pairs and 16 open reading frames were found encoding putative structural thermophilin T peptides and immunity peptides, a three component regulatory system, transportation proteins and a modification protein for the structural peptides. Among these, transposase and unknown function genes were found.The expression and organization of blp region genes were studied at transcriptional level using RT-PCR and northern experiments, revealing 5 possible operons. In addition, the possible structural bacteriocin genes blpU and blpK appeared to co-transcript as well as transcript independently, at least for the first one, and for this reason they were further studied with real time PCR experiments. Those experiments revealed higher levels of transcripts under conditions with antimicrobial activity and different levels of the co-transcripted peptides blpU-blpK in relation to independently transcripted blpU by condition but always with higher levels of blpU transcription.Following, a suitable transfer and expression system for the ACA-DC 0040 strain was searched for. While searching for, or trying to create, a suitable plasmid vector a native plasmid was found in ACA-DC 0040 whose sequence was identified in the present study. The plasmid consisting of 2780 base pairs, was named pST0040 and has three ORFs resembling a rolling circle replication gene, an unknown function protein coding gene and a small molecular weight heat sock protein coding gene, whose properties were studied. The pST0040 was used to create a plasmid vector which was transformed, with a very small efficiency, in S. thermophilus LMG 18311. The results confirmed the published low success transformation rates of the species and the need for additional research in this domain.Finally the putative structural thermophilin T peptides, blpU and blpK, were cloned separately in an E. coli overexpression plasmid vector and the produced recombined peptides showed a form of antimicrobial activity against the thermophilin T sensitive strain Lactococcus lactis CNRZ 117.

Ο Streptococcus thermophilus είναι ένα θετικό κατά Gram βακτήριο, προαιρετικά αναερόβιο, μη παθογόνο, άλφα αιμολυτικό και μέλος της ομάδας viridians του γένους Streptococcus. Ανήκει στα θερμόφιλα βακτήρια γαλακτικού οξέος (L.A.B.) και θεωρείται ασφαλής για κατανάλωση (Generally recognized as safe, G.R.A.S.). Χρησιμοποιείται ευρέως ως εναρκτήρια καλλιέργεια για την παραγωγή γαλακτοκομικών προϊόντων και θεωρείται ο δεύτερος πιο σημαντικός οργανισμός στη βιομηχανία γαλακτοκομικών προϊόντων. Το στέλεχος S. thermophilus ACA-DC 0040 από τη συλλογή του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών παράγει την βακτηριοσίνη θερμοφιλίνη T, η σύνθεση της οποίας φαίνεται ότι σχετίζεται με τον ρυθμό ανάπτυξης του οργανισμού και αποτέλεσε το αντικείμενο μελέτης της παρούσας διατριβής. Αρχικά διερευνήθηκε η ανάπτυξη του στελέχους ACA-DC 0040 σε μία σειρά θρεπτικών μέσων συναρτήσει της παραγωγής βακτηριοσίνης, της απομόνωσης γενετικού υλικού και της επιδεκτικότητας σε πειράματα μετασχηματισμού και επιλέχθηκαν τα βέλτιστα κατά περίπτωση. Βάσει κατατεθειμένων αλληλουχιών DNA άλλων στελεχών S. thermophilus, διερευνήθηκε και ανιχνεύθηκε ένας αντίστοιχος γενετικός τόπος blp στο ACA-DC 0040 ο οποίος ενδεχομένως σχετίζεται με την παραγωγή της θερμοφιλίνης Τ, κλωνοποιήθηκε και ταυτοποιήθηκε η αλληλουχία του. Ο γενετικός αυτός τόπος αποτελείται από 13092 ζεύγη βάσεων και εντοπίζονται σε αυτόν 16 ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης που κωδικοποιούν πιθανά δομικά πεπτίδια της θερμοφιλίνης Τ και πεπτίδια ανοσίας, ένα ρυθμιστικό σύστημα 3 στοιχείων, πρωτεΐνες για την εξωκυττάρια μεταφορά της φερομόνης και της θερμοφιλίνης, και μία πρωτεΐνη τροποποίησης των δομικών πεπτιδίων της. Μεταξύ αυτών εδράζονται γονίδια τρανσποζασών και άγνωστης λειτουργίας.Η έκφραση και η οργάνωση των γονιδίων της περιοχής blp μελετήθηκε σε μεταγραφικό επίπεδο με πειράματα RT-PCR και Northern, από τα οποία αποκαλύφθηκε η ύπαρξη 5 πιθανών οπερονίων. Επιπλέον, τα πιθανά δομικά γονίδια της βακτηριοσίνης blpU και blpK παρουσίασαν τόσο συμμεταγραφή, όσο και ξεχωριστή μεταγραφή τουλάχιστον στην περίπτωση του πρώτου και για το λόγο αυτό μελετήθηκαν περαιτέρω μέσω PCR πραγματικού χρόνου (real time PCR). Τα πειράματα αυτά αποκάλυψαν αυξημένα επίπεδα εμφάνισης των μεταγράφων σε συνθήκες παρουσίας αντιμικροβιακής δραστικότητας και διαφορετικά επίπεδα εμφάνισης των συμμεταγραφόμενων πεπτιδίων blpU-blpK από την ανεξάρτητη μεταγραφή του blpU ανά συνθήκη αλλά πάντα με μεγαλύτερα επίπεδα μεταγραφής του blpU.Στη συνέχεια επιχειρήθηκε η εύρεση ενός κατάλληλου συστήματος μεταφοράς και έκφρασης στο ACA-DC 0040. Στα πλαίσια αναζήτησης ή και κατασκευής κατάλληλου πλασμιδιακού φορέα εντοπίστηκε ένα φυσικό πλασμίδιο στο ACA-DC 0040 του οποίου η αλληλουχία ταυτοποιήθηκε και στην παρούσα εργασία. Το πλασμίδιο, μεγέθους 2780 ζευγών βάσεων, ονομάστηκε pST0040 και διαθέτει τρία ORFs που ομοιάζουν με γονίδιο αντιγραφής κυλιόμενου κύκλου, με γονίδιο παραγωγής πρωτεΐνης άγνωστης λειτουργίας και πρωτεΐνης θερμικού σοκ μικρού μοριακού βάρους, των οποίων οι ιδιότητες μελετήθηκαν. Το pST0040 χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή πλασμιδιακού φορέα με τον οποίο πραγματοποιήθηκε μετασχηματισμός, αν και σε πολύ μικρή συχνότητα, στο S. thermophilus LMG 18311. Τα αποτελέσματα από τα πειράματα των μετασχηματισμών επιβεβαίωσαν τα δημοσιευμένα ευρήματα χαμηλών ποσοστών επιτυχίας του μετασχηματισμού και την ανάγκη για επιπρόσθετες έρευνες στον τομέα.Τέλος, τα πιθανά δομικά πεπτίδια της θερμοφιλίνης Τ, blpU και blpK, κλωνοποιήθηκαν, το καθένα ξεχωριστά, σε φορέα υπερέκφρασης στο E. coli και τα ανασυνδυασμένα πεπτίδια που παρήχθησαν παρουσίασαν κάποιας μορφής αντιμικροβιακή δραστικότητα έναντι του ευαίσθητου στη θερμοφιλίνη Τ Lactococcus lactis CNRZ 117.