Μελέτες δομής και αυτοσυγκρότησης αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών ή τμημάτων τους που σχετίζονται με αμυλοειδώσεις

Abstract

Under pathological conditions, a large number of otherwise soluble proteins may fail to maintain their normal three-dimensional structure and thus, may undergo general or partial refolding of their polypeptide chains. Misfolded protein molecules may subsequently self-assemble into either amorphous or ordered protein aggregates, which share distinctive structural and tinctorial properties and are commonly called amyloid fibrils. Wild type or mutated amyloidogenic proteins, are transferred and deposited in different organs and/or tissues, either as extracellular accumulations (amyloid plaques) or as insoluble inclusion bodies. In any case, amyloid fibrils have been linked to the development of a broad class of diseases, called amyloidoses. Striking examples of this class are the neurodegenerative Alzheimer’s and Parkinson’s disease, prion diseases and other disorders, such as diabetes type II or a broad number of carcinomas. Overall, amyloidogenic proteins belong to a diverse group of macromolecules, displaying significant sequence and structural differences. At least, 35 human proteins are found to form pathological amyloid deposits in tissues, while this feature was associated with several mutations and/or microenvironment changes that lead to protein misfolding. The group of amyloidogenic proteins is constantly enriched with proteins that are found to form amyloid fibrils in vitro and surprisingly, have never been previously related with amyloidoses.Aiming at deciphering the molecular mechanisms, underlying amyloid fibril formation, in this thesis, A) we carried out a systematic /computational analysis on the diverse set of amyloidogenic proteins and also B) we performed targeted aggregation experiments on individual proteins, testing their amyloidogenic profile. A) The implication of more than one proteins in the progression of different aggregation disorders, together with the synergistic co-deposition of different amyloidogenic proteins in amyloid plaques of patients, highlights the necessity for a more universal approach, during the study of these proteins. In an attempt to address this pivotal need we constructed and analyzed a protein-protein interaction network of amyloidogenic proteins and their experimentally verified interactors, based on the complex network theory analysis. The Amyloid Interactome 1) gathers a group of heterogeneous proteins into a common biological interaction network, 2) assembles all known interconnections between well-characterized amyloidogenic proteins and proteins related to amyloid fibril formation and 3) unravels functional roles of all its constituent elements. To our knowledge, this integrated approach points to a new picture on protein aggregation and introduces for the first time a comprehensive protein map of amyloidogenicity. Eventually, Amyloid Interactome is expected to assist the development of novel therapeutic strategies in protein aggregation diseases.B) In this thesis, targeted aggregation experiments were focused on individual human proteins with a known or unexplored, until now, amyloidogenic profile. Α key milestone in the history of amyloid research was the idea that amyloid formation may be an inherent ability of proteins, under specific conditions. Appropriate biophysical methodologies are commonly used to record all distinct morphological and structural features of fibrillar structures that are either in in vivo or in in vitro aggregation assays.Under the right conditions, many proteins expose fibril-forming segments, which may be sufficient to cause aggregation and fibril formation. Following this idea, we turned our interest into small ‘aggregation-prone’ regions, which are considered responsible for the polymerization of proteins, associated with amyloidoses. In this thesis, short sequence stretches, named amyloidogenic determinants, were computationally identified and experimentally evaluated, utilizing several biophysical techniques (transmission electron microscopy, X-ray diffraction, polarizing microscopy, IR spectroscopy), whereas experimental results were combined in order to let us propose plausible polymerization models of each protein system.Experimental studies on known amyloidogenic proteins: -The oligomerization of human cystatin C is involved in the pathophysiology of a rare form of amyloidosis namely Icelandic hereditary cerebral amyloid angiopathy. Amyloidogenic proteins like cystatin C have been shown to form dimers and oligomers by exchange of subdomains of the monomeric proteins. In this work, in order to find the shortest stretch responsible to drive the fibril formation of cystatin C, we revealed that three ‘aggregation-prone’ segments of the protein self-assemble into typical amyloid fibrils and might be active ingredients of cystatin C aggregation. Based on these results, we also demonstrated two plausible self-aggregation pathways, which prove the fundamental contribution of all three peptides in forming the ‘aggregation-prone’ core of human cystatin C.-The rapid aggregation of amylin is implicated in the pathology of diabetes type II. Although the entire sequence of human amylin has been denoted as amyloidogenic, literature data reveal that both the N- and C-terminal of amylin were excluded from any aggregation study. Incomplete knowledge on the aggregation potency of the terminal regions of amylin allowed us to design 3 distinct groups of amyloidogenic determinants, corresponding to N- and C- terminals of amylin. The aggregation properties of each peptide were confirmed by several biophysical techniques, whereas in addition to the self-interactions, cross-amyloid interactions between amylin and separate amyloidogenic determinants were evaluated. Overall, our results offer a novel molecular basis for understanding the contribution of the terminal regions of amylin in the self-assembly of the protein that may prove to be powerful new directions for future therapies to combat the devastating consequences of diabetes.Experimental studies on proteins with unexplored amyloidogenic properties: -Proinsulin C-peptide or C-peptide, a 31 amino acid long molecule, was for several years a forgotten parameter in insulin studies. Much time and effort has been spent in exploring all functional features of C-peptide, only a few studies, though, have addressed C-peptide oligomerization and link this procedure with Diabetes. Early studies of C-peptide self-aggregation stated clearly that C-peptide on its own does not give rise to amyloid fibrils, a finding consistent with the extremely weak amyloidogenic profile of C-peptide. Taking all the above studies into consideration, in the present thesis, we decided to test the propensity of full length C-peptide to self-assemble into amyloid fibrils, in vitro. Our experimental work clearly shows that C-peptide self-assembles into amyloid-like fibrils and therefore, the aggregation propensity of C-peptide is a characteristic novel feature that should be related to physiological and also pathological conditions. A model for amyloid fibril formation for C-peptide, based on the chameleon properties of its sequence, is also provided.-Clusterin is an extracellular, heterodimeric chaperone, which is present in all disease-associated extracellular amyloid deposits. To date, clusterin’s contribution in amyloid formation and protein deposition in vivo is poorly understood. The intrinsically disordered nature of clusterin, together with its ability to specifically interact with a wide range of amyloidogenic molecules has prompted us to thoroughly study its amyloidogenic profile. Computational analysis led us to synthesize and experimentally study five potent amyloidogenic determinants, derived from the clusterin α-chain sequence. Our experimental results revealed that all five peptides self-assemble into amyloid-like fibrils in vitro, fulfilling all amyloid criteria. This fact provides a potent indication that at least the clusterin α-chain intrinsically exhibits amyloidogenicity and may also form amyloid-like fibrils in vitro. This finding also raises the possibility that, at least in some circumstances, amyloidogenic determinants derived from clusterin in vivo could be a therapeutic tool in the fight against protein aggregation disorders.-Stefin A, a molecule evolutionary related to the amyloidogenic cystatin C, follows the same polymerization pathway, even though its role in amyloidosis pathology is still unknown. Stefin A provides an important protective function as an intracellular inhibitor of cysteine proteases. However, it has been suggested that oligomers of stefin A have been detected in several carcinomas. In order to determine the hidden amyloidogenic profile of stefin A, four computationally predicted amyloidogenic determinants were experimentally tested. From this work it is clear that stefin A consists of amyloidogenic regions, which render the polypeptide chain prone to protein aggregation, probablt following a polymerization mechanism analogous to cystatin C.

Κάτω από μη φυσιολογικές συνθήκες, σφαιρικές υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες αδυνατούν να αποκτήσουν τη φυσιολογική τους στερεοδιάταξη και οδηγούνται σε ένα εναλλακτικό – μη-κανονικό – δίπλωμα της πολυπεπτιδικής τους αλυσίδας στο χώρο. Ως συνέπεια αυτού του γεγονότος, τα μη-φυσιολογικά διπλωμένα πρωτεϊνικά μόρια αυτοσυγκροτούνται είτε σε άμορφα πρωτεϊνικά συσσωματώματα, είτε σε οργανωμένα πρωτεϊνικά συσσωματώματα, που εμφανίζουν ορισμένες εξειδικευμένες ιδιότητες και χαρακτηρίζονται ως αμυλοειδή ινίδια. Οι πρωτεΐνες με ‘τάση να δημιουργούν αμυλοειδή ινίδια’ ή ‘αμυλοειδογόνες’ πρωτεΐνες, είτε στη φυσιολογική είτε στη μεταλλαγμένη τους μορφή, προσβάλουν όργανα ή/και ιστούς και εναποτίθενται, σχηματίζοντας είτε εξωκυτταρικές συναθροίσεις (αμυλοειδείς πλάκες) είτε ενδοκυτταρικά έγκλειστα. Σε κάθε περίπτωση, η εναπόθεση των αμυλοειδών ινιδίων οδηγεί στην εμφάνιση μίας ευρείας ομάδας ασθενειών, οι οποίες ονομάζονται αμυλοειδώσεις. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αμυλοειδώσεων αποτελούν οι νευροεκφυλιστικές νόσοι Alzheimer’s και Parkinson’s, οι σπογγώδεις εγκεφαλοπάθειες και άλλες ασθένειες, όπως ο διαβήτης τύπου ΙΙ ή διάφοροι τύποι καρκίνου. Συνολικά, οι αμυλοειδογόνες πρωτεΐνες είναι ένα ‘ιδιότυπο’ σύνολο μορίων, που διαφέρουν μεταξύ τους σε επίπεδο ακολουθίας, δομής, αλλά και λειτουργίας. Τουλάχιστον 35 διαφορετικές ανθρώπινες πρωτεΐνες έχει βρεθεί να εναποτίθενται με τη μορφή αμυλοειδών ινιδίων σε ιστούς, ενώ εξελικτικά η δημιουργία τους έχει συσχετιστεί με γενετικές τροποποιήσεις ή/και αλλαγές του μικροπεριβάλλοντος, που επιδρούν στη φυσιολογική διαδικασία διπλώματος των πρωτεϊνών. Το σύνολο των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών εμπλουτίζεται συνεχώς, καθώς όλο και περισσότερες πρωτεΐνες, που προηγουμένως δεν είχαν συσχετιστεί με κάποια αμυλοείδωση, εμφανίζουν την τάση να δημιουργούν αμυλοειδή ινίδια in vitro. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε Α) ‘μακροσκοπική’ – υπολογιστική μελέτη στο ετερόκλητο σύνολο των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών, αλλά και Β) ‘μικροσκοπική’ – πειραματική μελέτη σε επιλεγμένα πρωτεϊνικά συστήματα, στα πλαίσια της αποκρυπτογράφησης των ιδιοτήτων, των μηχανισμών, καθώς και των ιδιαιτεροτήτων των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη δημιουργία αμυλοειδών ινιδίων. Α) Πολλά βιβλιογραφικά δεδομένα μαρτυρούν την συν-εναπόθεση δύο ή και περισσότερων πρωτεϊνών στις συναθροίσεις αμυλοειδών ινιδίων ασθενών, με άγνωστη όμως μέχρι σήμερα τη συμμετοχή τους στην εξέλιξη των αμυλοειδώσεων. Στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής το βιολογικό ερώτημα της ‘συνεύρεσης των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών’ σε ασθενείς μελετήθηκε μακροσκοπικά με εφαρμογή της θεωρίας γράφων, προκειμένου να αποσαφηνιστούν οι ιδιότητες των πρωτεϊνών, που σχετίζονται με τη δημιουργία αμυλοειδών ινιδίων σε παθολογικές καταστάσεις, ως σύνολο. Το δίκτυο των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών (Amyloid Interactome) που κατασκευάστηκε και οπτικοποιήθηκε υπολογιστικά 1) συσχέτισε ένα σύνολο από λειτουργικά μη-συσχετιζόμενες πρωτεΐνες σε ένα κοινό δίκτυο, 2) αποκάλυψε σημαντικές άμεσες και έμμεσες ‘διασυνδέσεις’ μεταξύ των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών και 3) ανέδειξε ελκυστικούς υποψηφίους για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών τακτικών στη μελέτη των αμυλοειδώσεων. Σύμφωνα με τα όσα γνωρίζουμε μέχρι σήμερα, η προσέγγιση αυτή αποκαλύπτει νέες οδούς επικοινωνίας στην πρωτεϊνική συσσωμάτωση και είναι η πρώτη προσπάθεια μελέτης των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών ως ένα ενοποιημένο σύστημα. Αναμένεται ότι τα αποτελέσματα της υπολογιστικής αυτής ανάλυσης θα αξιοποιηθούν σε στοχευμένες πειραματικές προσεγγίσεις στο μέλλον.Β) Στον αντίποδα της συστηματικής ανάλυσης των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών, η πειραματική προσέγγιση της παρούσας διατριβής εστιάστηκε σε επιλεγμένα ανθρώπινα πρωτεϊνικά μόρια, τόσο επιβεβαιωμένων αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών, όσο και πρωτεϊνών με ανεξερεύνητες, μέχρι σήμερα, αμυλοειδογόνες ιδιότητες. Τομή στη μελέτη των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών υπήρξε η πρόταση ότι ο σχηματισμός αμυλοειδών ινιδίων είναι μία εγγενής ιδιότητα των πολυπεπτιδικών αλυσίδων, κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες. Έτσι, οι ιδιότητες των αμυλοειδών ινιδίων, οι οποίες αποκαλύπτονται με κατάλληλες μεθοδολογίες, αποτελούν διαγνωστικά κριτήρια για την καταγραφή των κοινών μορφολογικών και δομικών χαρακτηριστικών (cross-β αρχιτεκτονική) των ινιδιακών δομών, που είτε εντοπίζονται σε ασθενείς είτε εμφανίζονται σε μελέτες συσσωμάτωσης in vitro. Η ιδέα ότι μικρές, ‘επιρρεπείς προς συσσωμάτωση’, περιοχές των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών, συμμετέχουν ενεργά στον πολυμερισμό τους σε ινίδια και κατ’ επέκταση στην εμφάνιση της αμυλοείδωσης, έστρεψε το ενδιαφέρον μας στη μελέτη τμημάτων των πεπτιδικών αλυσίδων των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών, τα οποία πιθανά φέρουν συμπυκνωμένη την πληροφορία της αμυλοειδογονικότητας. Τα μικρά αμυλοειδογόνα τμήματα, που ονομάζονται αμυλοειδογόνοι καθοριστές, εντοπίστηκαν με υπολογιστικές μεθόδους, ενώ η πειραματική επιβεβαίωση των ιδιοτήτων τους πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός συνόλου βιοφυσικών μεθόδων (ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης, περίθλαση ακτίνων-Χ, πολωτική μικροσκοπία, φασματοσκοπία υπερερύθρου), σε μεγάλο εύρος συνθηκών. Τέλος, η μελέτη των ιδιοτήτων πολυμερισμού και αυτοσυγκρότησης των αμυλοειδογόνων καθοριστών επέτρεψε την πρόταση πιθανών τρισδιάστατων μοντέλων πολυμερισμού, των υπό μελέτη πρωτεϊνικών συστημάτων. Οι πειραματικές μελέτες σε επιβεβαιωμένες αμυλοειδογόνες πρωτεΐνες:-Η κυστατίνη C, η πρώτη αμυλοειδογόνος πρωτεΐνη που μελετήθηκε πειραματικά στα πλαίσια της διατριβής, είναι υπεύθυνη για μία σπάνια μορφή αμυλοείδωσης, που ονομάζεται εγκεφαλική αγγειοπάθεια Ισλανδικού τύπου, ενώ αποδεικνύεται ότι αυτοσυγκροτείται σε ολιγομερή, ακολουθώντας ένα πολύπλοκο μηχανισμό πολυμερισμού. Προκειμένου να εντοπίσουμε τμήματα της πρωτεΐνης με υψηλό αμυλοειδογόνο δυναμικό, τρεις πιθανοί αμυλοειδογόνοι καθοριστές της κυστατίνης C μελετήθηκαν πειραματικά και αξιολογήθηκε ο ρόλος τους στην αυτοσυγκρότηση της πρωτεΐνης. Η επιβεβαίωση της εγγενούς αμυλοειδογονικότητας των καθοριστών της κυστατίνης C μας οδήγησε στην πρόταση δύο πιθανών μοντέλων πολυμερισμού και αυτοσυγκρότησης, τα οποία εμπλέκουν τα μικρά αμυλοειδογόνα τμήματα και προτείνουν την ενεργή συμμετοχή τους στον cross-β πυρήνα των ινιδίων της ανθρώπινης κυστατίνης C.-Η ραγδαία αυτοσυγκρότηση της αμυλίνης που ευθύνεται για την πρόκληση του διαβήτη τύπου ΙΙ, υπήρξε το δεύτερο πεδίο πειραματικής μελέτης της διατριβής. Παρότι, η πεπτιδική αλυσίδα της αμυλίνης φέρει υψηλή αμυλοειδογονικότητα, η εκτενής ανάλυση των βιβλιογραφικών δεδομένων απέδειξε ότι το αμινοτελικό (N-terminal) και καρβοξυτελικό (C-terminal) τμήμα της, είναι δύο περιοχές στις οποίες δεν έχει πραγματοποιηθεί στοχευμένη και συστηματική μελέτη. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής εντοπίστηκαν αμυλοειδογόνοι καθοριστές στα ελλιπώς μελετημένα ακραία τμήματα της ορμόνης, ενώ παράλληλα σχεδιάστηκαν ομάδες μεταλλαγμένων αμυλοειδογόνων καθοριστών, των τμημάτων αυτών. Οι βιοφυσικές μέθοδοι κατέγραψαν τις ιδιότητες όλων των πεπτιδίων και τέλος, οι μελέτες συνδυαστικής επώασης με της αμυλίνης με τα υπό μελέτη πεπτίδια συνέβαλαν καθοριστικά στη μελέτη της συνεισφοράς του αμινοτελικού και του καρβοξυτελικού τμήματος στην αυτοσυγκρότηση της αμυλίνης. Συνολικά, η πειραματική προσέγγιση στην αμυλοειδογόνο ορμόνη αμυλίνη συνετέλεσε στην εξαγωγή σημαντικών συμπερασμάτων που σχετίζονται με τον πολυμερισμό της ορμόνης και μπορεί να επιτρέψουν στο μέλλον τη στοχευμένη σχεδίαση πεπτιδίων-αναστολέων της αμυλοειδογονικότητας της.Οι πειραματικές μελέτες σε πρωτεΐνες με ανεξερεύνητες αμυλοειδογόνες ιδιότητες:-Το C-πεπτίδιο της προϊνσουλίνης ή C-πεπτίδιο, ένα μόριο 31 αμινοξικών καταλοίπων, ήταν για πολλά χρόνια μία ξεχασμένη παράμετρος στις μελέτες που αφορούσαν την ινσουλίνη. Η εμπλοκή του C-πεπτιδίου στο διαβήτη υπήρξε το έναυσμα για τη σε βάθος μελέτη των ανεξερεύνητων ιδιοτήτων αυτοσυγκρότησης του πεπτιδίου. Ωστόσο, τo εξαιρετικά ασθενές αμυλοειδογόνο προφίλ του δεν επέτρεψε τον εντοπισμό μικρών αμυλοειδογόνων τμημάτων κατά μήκος της αλληλουχίας του και έτσι, στο συγκεκριμένο σύστημα μελέτης πραγματοποιήθηκαν πειράματα αυτοσυγκρότησης στην πλήρη ακολουθία του C-πεπτιδίου. Οι βιοφυσικές μελέτες, στα πλαίσια της διατριβής, αποκάλυψαν για πρώτη φορά την ικανότητά του C-πεπτιδίου να οργανώνεται σε ινιδιακές δομές, που πληρούν τα κριτήρια των αμυλοειδών ινιδίων, ενώ ταυτόχρονα, τμήματα του πεπτιδίου που αποτελούν αλληλουχίες-χαμαιλέοντες επέτρεψαν την πρόταση ενός πιθανού μοντέλου που καταγράφει το μονοπάτι της τρισδιάστασης αυτοσυγκρότησής του.-Η κλαστερίνη, μία σημαντική ετεροδιμερής πρωτεΐνη-συνοδός, που συνεντοπίζεται σε αμυλοειδείς εναποθέσεις ασθενών με νευροεκφυλιστικές νόσους, αποτελεί ένα ακόμα σύστημα μελέτης με ανεξευρεύνητες αμυλοειδογόνες ιδιότητες. Η εγγενής μη-δομημένη φύση της κλαστερίνης, σε συνδυασμό με την ικανότητά της να αλληλεπιδρά ειδικά με ένα μεγάλο εύρος αμυλοειδογόνων μορίων μας ώθησε στη διεξοδική μελέτη της αμυλοειδογονικότητάς της. Η α-αλυσίδα της κλαστερίνης, η οποία φέρει σημαντικούς επιτόπους αλληλεπίδρασης με αμυλοειδογόνα μόρια, αναλύθηκε υπολογιστικά και τα πέντε πιθανά αμυλοειδογόνα τμήματα που εντοπίστηκαν σε αυτή, επιβεβαιώθηκαν πειραματικά με βιοφυσικές μεθόδους, ως αμυλοειδογόνοι καθοριστές. Η αναγνώριση των καθοριστών στην α-αλυσίδα της κλαστερίνης ανέδειξε δυνητικούς αναστολείς στις νευροεκφυλιστικές νόσους, καθώς αναμένεται ότι με τον κατάλληλο σχεδιασμό πεπτιδίων-αναστολέων που αλληλεπιδρούν ειδικά με την κλαστερίνη, μπορεί κανείς να ανακόψει την εξέλιξη του πολυμερισμού άλλων αμυλοειδογόνων μορίων που αλληλεπιδρούν με αυτή. -Τέλος, η στεφίνη Α, ένα συγγενικό μόριο της αμυλοειδογόνου κυστατίνης C, ακολουθεί παρόμοιο μονοπάτι πολυμερισμού, ωστόσο, δεν έχει καταγραφεί μέχρι σήμερα ως αμυλοειδογόνο πρωτεϊνικό μόριο. Η στεφίνη Α δρα φυσιολογικά ως ενδοκυτταρικός αναστολέας πρωτεασών, ενώ τα ενδοκυτταρικά μη-φυσιολογικά ολιγομερή της παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον σε διάφορους τύπους καρκίνων. Στα πλαίσια διερεύνησης του αμυλοειδογόνου δυναμικού της πρωτεΐνης αναγνωρίστηκαν τέσσερις μικροί αμυλοειδογόνοι καθοριστές, οι οποίοι μελετήθηκαν πειραματικά. Ο εντοπισμός τμημάτων με αμυλοειδογόνα χαρακτηριστικά στη στεφίνη Α μπορεί να εξυπηρετήσει στη μελλοντική διερεύνηση ενός πιθανού μηχανισμού συσσωμάτωσης ολόκληρης της πρωτεΐνης σε αμυλοειδή ινίδια, με μηχανισμούς που ομοιάζουν σε εκείνους της αμυλοειδογόνου κυστατίνης C.