Μελέτη της συγκέντρωσης μεταλλοπρωτεϊνασών (MMPs) στη θεμέλια ουσία σκολιωτικών μεσοσπονδύλιων δίσκων με τη χρήση συσκευής ilizarov σε επίμυες

Abstract

Introduction-Aim: Intervertebral disc degeneration derives from an imbalance between degradation and synthesis of matrix components. Asymmetric loading of the disc, causes molecular damage, which is evident at both the microscopic and macroscopic level. The aim of the present experimental study was to evaluate immunohistochemically the role of MMP-1 and MMP-12 in degeneration of rat tail intervertebral disc and the evaluation of MMP-12 activity and expression after application of asymmetric loading and to evaluate the impact of the degree of the deformity on the expression of the above enzymes. Material-Method: An Ilizarov type mini external fixator was applied between the 9th and 10th vertebrae of 45 female Wistar rats, matched for their age, weight and height (aged 2 months old, weighted 200 ± 10 gramms), in order to create a scoliotic deformity. Rats were divided into three groups according to the degree of the deformity. In group I, the deformity was 10o, in group II 30o and in group III 50o. The rats were euthanized on the 35th day after surgery. Fifteen discs (five of each group) were analyzed by using Western blot technique and zymography for detection of pro-MMP12 and active MMP12. Values were normalized and quantified towards beta-actin. Thirty discs (ten of each group) were evaluated immunohistochemically and were scored semiquantitatively for immunopositivity of MMP-1 and MMP-12. The adjacent healthy intervertebral discs were used as control group. Statistical analysis was performed with the use of the nonparametric Mann-Whitney U test and the unpaired t-test. Statistically significance was designated at the p< 0.05 level. Results: Pro-MMP-12 was detected at the area of 54 kDa and its expression increased as the deformity progressed. Active MMP-12 was detected at the area of 22 kDa and its value dropped in group I and II compared with controls and interestingly increased significantly in group III. MMP-1 and MMP-12 immunopositivity was detected in disc cells of annulus fibrosus but not in nucleus pulposus of all intervertebral disc specimens examined. In group I, the percentage of MMP-1 positive disc cells in annulus fibrosus was 20% (10% of chondrocytes, 25% of fibroblasts), while MMP-12 staining was evident in 20% of fibroblasts (not in chondrocytes) and was slightly increased at the concave side of the disc. In group II, 43% of disc cells expressed MMP-1 (35% of chondrocytes, 50% of fibroblasts), and 50% of disc cells expressed MMP-12 (30% of chondrocytes, 50% of fibroblasts) mainly at the concave side of the periphery of annulus fibrosus. At the periphery of annulus fibrosus and at the transition zone, clusters of disc cells were differentiated into chondrocytes, expressing MMP-12. In group III, 75% of disc cells expressed MMP-1 (50% of chondrocytes, 80% of fibroblasts) and 80% of disc cells expressed MMP-12 (50% of chondrocytes, 90% of fibroblasts). In group III, disc cell population diminished predominantly at the concave side together with a severe disorganization of matrix microstructure. MMP-1 and MMP-12 positivity was significantly correlated with the degree of the deformity (p<0,001). When analysing the difference of MMP-1 and MMP-12 expression between the convex and the concave side, it was not statistically significant in group I (p=0,6 for MMP-1, p=0,48 for MMP-12), but was statistically significant in group II and III (p<0,01 for MMP-1, p<0,001 for MMP-12). Conclusion: The present study showed that an experimentally induced scoliotic deformity by the application of asymmetric forces on rat tail intervertebral discs results in over-expression of MMP-1 and MMP-12, which is dependent on the degree of the deformity and on the side of the wedged disc. Asymmetric loading results in disc degeneration by degradation of fibrilin collagens and elastin as a consequence of MMP-1 and MMP-12 increased production and by reducing or differentiating disc cells.

Εισαγωγή-Σκοπός: Η εκφύλιση του μεσοσπονδυλίου δίσκου προκύπτει από την διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ σύνθεσης και αποδόμησης των συστατικών της θεμέλιας ουσίας. Η ασύμμετρη φόρτιση του δίσκου προκαλεί βλάβες σε μοριακό επίπεδο, οι οποίες γίνονται εμφανείς τόσο σε μικροσκοπικό όσο και σε μακροσκοπικό επίπεδο. Σκοπός της παρούσης πειραματικής μελέτης, ήταν η εκτίμηση με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους του ρόλου της MMP-1 και της MMP-12 στην εκφύλιση μεσοσπονδύλιων δίσκων ουράς επίμυων καθώς και η μέτρηση της έκφρασης και της ενεργότητας της MMP-12, έπειτα από την εφαρμογή ασύμμετρων δυνάμεων καθώς και η εκτίμηση της επίδρασης του βαθμού της παραμόρφωσης στην έκφραση των παραπάνω ενζύμων. Υλικό - Μέθοδος: Μεταξύ 9ου και 10ου ιερού σπονδύλου σε ουρές επίμυων (Wistar rats) εφαρμόσθηκε μίνι συσκευή εξωτερικής οστεοσύνθεσης τύπου Ilizarov προκειμένου να δημιουργηθεί σκολιωτική παραμόρφωση. Χρησιμοποιήθηκαν 45 επίμυες, σταθμισμένοι ως προς την ηλικία, το βάρος και το ύψος τους (ηλικία 2 μηνών, βάρος 200±10 γραμμάρια). Οι επίμυες χωρίσθηκαν σε τρεις ομάδες ανάλογα με το βαθμό της παραμόρφωσης. Στην ομάδα Ι η παραμόρφωση ήταν 10o, στην ομάδα ΙΙ 30o και στην ομάδα ΙΙΙ 50o. Την 35η ημέρα έγινε ευθανασία των πειραματοζώων. Δεκαπέντε δίσκοι (πέντε από κάθε ομάδα) αναλύθηκαν με την τεχνική κατά Western και με ζυμογράφημα για την ανίχνευση της pro-MMP12 και της ενεργού MMP12. Οι τιμές ομαλοποιήθηκαν ως προς τη β-ακτίνη. Τριάντα μεσοσπονδύλιοι δίσκοι (δέκα από κάθε ομάδα) αναλύθηκαν ανοσοϊστοχημικά και βαθμονομήθηκαν με ημιποσοτικές μεθόδους για ανοσοθετικότητα στην MMP-1 και MMP-12. Οι παρακείμενοι υγιείς μεσοσπονδύλιοι δίσκοι χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Η στατιστική ανάλυση έγινε με το μη παραμετρικό Mann-Whitney U test και με το unpaired t-test. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίσθηκε ως p< 0.05. Αποτελέσματα: Η pro-MMP-12 ανιχνεύτηκε στην περιοχή των 54 kDa και η έκφρασή της αυξανόταν καθώς μεγάλωνε η παραμόρφωση. Η ενεργός MMP-12 ανιχνεύτηκε στην περιοχή των 22 kDa και η συγκέντρωσή της στην ομάδα Ι και ΙΙ ήταν ελαττωμένη συγκριτικά με τους μάρτυρες, αλλά αυξανόταν σημαντικά στην ομάδα ΙΙΙ. Ανοσοθετικότητα ανιχνεύτηκε για την MMP-1 και MMP-12 σε όλα τα κύτταρα του ινώδους δακτυλίου, αλλά όχι στον πηκτοειδή πυρήνα των μεσοσπονδύλιων δίσκων που εξετάσθηκαν. Στην ομάδα Ι, το ποσοστό των θετικών στην MMP-1 κυττάρων του ινώδους δακτυλίου ήταν 20% (10% των χονδροκυττάρων, 25% των ινοβλαστών), ενώ για την MMP-12 η χρώση ήταν θετική στο 20% των ινοβλαστών (όχι των χονδροκυττάρων) και ήταν ελαφρώς αυξημένη στην κοίλη πλευρά του δίσκου. Στην ομάδα ΙΙ, το 43% των κυττάρων του δίσκου εξέφραζαν την MMP-1 (35% των χονδροκυττάρων, 50% των ινοβλαστών) και 50% των κυττάρων εξέφραζαν την MMP-12 (30% των χονδροκυττάρων, 50% των ινοβλαστών), κυρίως στην περιφέρεια του ινώδους δακτυλίου της κοίλης πλαυράς. Στην μεταβατική ζώνη και στην περιφέρεια του ινώδους δακτυλίου, παρατηρήθηκαν συσσωματώσεις δισκικών κυττάρων, τα οποία παρουσίαζαν μια χόνδρινη διαφοροποίηση και ήταν θετικά ως προς την MMP-12. Στην ομάδα ΙΙΙ, το 75% των δισκικών κυττάρων εξέρφραζαν την MMP-1 (50% των χονδροκυττάρων, 80% των ινοβλαστών) και 80% των δισκικών κυττάρων εξέφραζαν την MMP-12 (50% των χονδροκυττάρων, 90% των ινοβλαστών). Στην ομάδα ΙΙΙ, ο πληθυσμός των κυττάρων ήταν ελαττωμένος, ιδίως στην κοίλη πλευρά του δίσκου, ταυτόχρονα με μια σοβαρή αποδιοργάνωση της μικροαρχιτεκτονικής της θεμέλιας ουσίας. Η ανοσοθετικότητα της MMP-1 και της MMP-12 συσχετιζόταν στατιστικά σημαντικά με το βαθμό της παραμόρφωσης (p<0,001). Από την ανάλυση της διαφοράς της έκφρασης της MMP-1 και MMP-12 μεταξύ κοίλης και κυρτής πλαυράς, προέκυψε πως αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική στην ομάδα Ι (p=0,6 για την MMP-1, p=0,48 για την MMP-12), ενώ ήταν στατιστικά σημαντική στις ομάδας ΙΙ και ΙΙΙI (p<0,01 για την MMP-1, p<0,001 για την MMP-12). Συμπέρασμα: Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η πειραματική πρόκληση σκολιωτικής παραμόρφωσης μετά από την εφαρμογή ασύμμετρων δυνάμεων σε μεσοσπονδύλιους δίσκους ουράς επίμυων, προκαλεί αυξημένη έκφραση της MMP-1 και της MMP-12, οι οποίες εξαρτώνται από το βαθμό της παραμόρφωσης και την περιοχή του σφηνοειδώς παραμορφωμένου δίσκου. Η ασύμμετρη φόρτιση οδηγεί σε εκφύλιση του μεσοσπονδυλίου δίσκου με την αποδόμηση των ινιδικών κολλαγόνων και της ελαστίνης από την αυξημένη παραγωγή MMP-1 και MMP-12 καθώς και από την ελάττωση του αριθμού ή τη διαφοροποίηση των δισκικών κυττάρων.