Ανίχνευση μορίων και πολυμορφισμών που πιθανόν επηρεάζουν την παθογένεση των νευροεκφυλιστικών νοσημάτων συμπεριλαμβανομένων των ασθενειών Prion

Abstract

Scrapie is a fatal neurodegenerative disease of sheep and goats, characterized by the conformational conversion of the normal PrPC protein (encoded by the prnp gene). This conversion is the result of PrPC interaction with its β-sheet rich isoform, termed PrPSc. The latter is considered as the infectious agent of scrapie. Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) in the caprine prnp gene have been associated with some degree of protection against goat scrapie. However, scrapie resistance selective breeding schemes have not been applied in goat populations in Greece and any other country, due to the scarcity of available data on caprine prnp genetic variability and corresponding protective alleles. The present study aimed: a) at the assessment of the caprine prnp genetic variability in Greek goats, through the detection of SNPs in the gene's coding region and b) at the study of selected polymorphisms in a cell culture model of scrapie, in order to correlate polymorphisms with resistance or susceptibility to the disease and to detect possible mechanisms, through which the resistance associated SNPs may confer their protective effect. For the study of the caprine prnp genetic variability, the prnp coding region was analyzed through Sanger-based sequencing (436 samples from herds located in Northern Greece were studied), sequencing data were aligned to the reference sequence and the detected polymorphisms' frequencies were determined. For the in vitro study of selected polymorphisms, caprine PrP variants encompassing the polymorphisms of interest, were expressed in scrapie affected murine neuroblastoma cells (22L-scN2a) and the percentage of these variants that was converted to PrPSc was assessed. Variants displaying a lower conversion efficiency compared to the wild type caprine PrP were associated with increased protection against scrapie. The present study enhanced existing knowledge concerning prnp variability in Greek goats, by detecting new polymorphic positions and determining the frequencies of scrapie-protective alleles in a representative population of indigenous dairy Greek goats. The results of this study suggest that the caprine prnp alleles S146, Κ222 and Q211 should be considered for a selection goal in the design and implementation of scrapie resistance breeding programs for dairy goats in Greece; their protective effect in the examined population should be confirmed by large-scale studies considering also their association with production traits. Moreover, the in vitro study of selected caprine prnp polymorphisms in a cell model of scrapie, confirmed the protective effect of the S146 polymorphism and enabled the study of some of its biosynthesis properties, revealing the potentially protective mechanisms of its protective action.

Η scrapie αποτελεί λοιμώδες νευροεκφυλιστικό νόσημα των προβάτων και των αιγών. Η νόσος χαρακτηρίζεται από τη δομική τροποποίηση της φυσιολογικής PrPC πρωτεΐνης (προϊόν του prnp γονιδίου), που προκύπτει ως αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης της PrPC με μια πλούσια σε β-ελάσματα ισομορφή της (PrPSc). Η τελευταία πιστεύεται ότι αντιστοιχεί στον παθογόνο παράγοντα της scrapie. Πολυμορφισμοί του prnp γονιδίου αιγών έχουν συσχετιστεί με ορισμένο βαθμό προστασίας έναντι της scrapie. Ωστόσο, τα περιορισμένα διαθέσιμα δεδομένα σχετικά με τη γενετική ποικιλομορφία του prnp γονιδίου αιγών και των αλληλομόρφων του που σχετίζονται με ανθεκτικότητα έναντι της scrapie, δεν επέτρεψαν το σχεδιασμό και την εφαρμογή προγραμμάτων επιλεκτικών διασταυρώσεων που αποσκοπούν στην αύξηση των συχνοτήτων των προστατευτικών αλληλομόρφων σε πληθυσμούς αιγών, τόσο στην Ελλάδα όσο και σε άλλες χώρες. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν: α) η ανίχνευση πολυμορφισμών στην κωδικοποιούσα περιοχή του prnp γονιδίου ελληνικών αιγών, με σκοπό την εκτίμηση της γενετικής ποικιλομορφίας του prnp γονιδίου και β) η μελέτη επιλεγμένων πολυμορφισμών σε κυτταρικό μοντέλο της scrapie, προκειμένου να διερευνηθεί η συσχέτισή τους με τη νόσο και να προσδιοριστούν πιθανοί μηχανισμοί που σχετίζονται με προστασία έναντι της scrapie. Για τη μελέτη της ποικιλομορφίας του prnp γονιδίου, εφαρμόστηκε αλληλούχιση κατά Sanger στο επιθυμητό τμήμα του prnp γονιδίου αιγών (436 δείγματα από εκτροφές της Βορείου Ελλάδος), σύγκριση των αποτελεσμάτων αλληλούχισης με την αντίστοιχη ακολουθία αναφοράς και προσδιορισμός της συχνότητας των πολυμορφισμών στο σύνολο του πληθυσμού που μελετήθηκε. Για την in vitro μελέτη επιλεγμένων πολυμορφισμών, ποικιλίες της PrP αιγών που έφεραν τους πολυμορφισμούς ενδιαφέροντος εκφράστηκαν σε μολυσμένα με το στέλεχος 22L της scrapie κύτταρα νευροβλαστώματος ποντικού (22L-scN2a) και εκτιμήθηκε το ποσοστό τροποποίησής τους προς PrPSc. Ποικιλίες με μικρότερο βαθμό τροποποίησης σε σχέση με την αγρίου τύπου PrP αιγών συσχετίστηκαν με ορισμένο βαθμό προστασίας έναντι της scrapie. Η παρούσα διδακτορική διατριβή συνέβαλλε σημαντικά στην ενίσχυση της υπάρχουσας γνώσης που αφορά την ποικιλομορφία του prnp γονιδίου στις Ελληνικές αίγες, μέσω της ανίχνευσης νέων πολυμορφικών θέσεων και του προσδιορισμού των συχνοτήτων προστατευτικών έναντι της scrapie αλληλομόρφων, σε αντιπροσωπευτικό δείγμα Ελληνικών αιγών. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την έρευνα αυτή συνηγορούν υπέρ της επιλογής των αλληλομόρφων S146, Κ222 και Q211 του prnp γονιδίου αιγών για το σχεδιασμό και την εφαρμογή προγραμμάτων επιλεκτικών διασταυρώσεων με σκοπό την αντιμετώπιση της scrapie στις Ελληνικές αίγες, εφόσον επιβεβαιωθεί η προστατευτική τους δράση στις Ελληνικές αίγες μέσω μεγάλης κλίμακας μελετών και εκτιμηθεί η συσχέτισή τους με παραγωγικά χαρακτηριστικά των ζώων. Επιπρόσθετα, η μελέτη ορισμένων από τους φυσικά απαντώμενους πολυμορφισμούς του prnp γονιδίου αιγών που μελετήθηκαν στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής σε κυτταρικό μοντέλο της νόσου, επιβεβαίωσε την προστατευτική δράση του αλληλομόρφου S146 και παράλληλα επέτρεψε τη μελέτη χαρακτηριστικών της βιοσύνθεσης του, που πιθανόν να συμβάλλουν στην κατανόηση της προστατευτικής του δράσης.