Το σύστημα της πρωτεΐνης C και η γενετική της θρομβοφιλίας

Abstract

The protein C pathway plays an important role in the regulating of formation of fibrin. The normal blood flow depends on the precise binding on the surface of endothelial cells of thrombin (T), thrombomodulin (TM), protein C (PC) and (endothelial receptor protein C) EPCR. Thrombomodulin is an important cofactor in the protein C pathway and an endothelial receptor for thrombin which plays an important role in the regulation of blood clotting, reducing the activity of thrombin and enhancing the activation of protein C. Scanning of thrombomodulin gene in patients who had one or more thrombotic episodes in young age has revealed several mutations and/or polymorphisms , some of which are associated with venous thrombosis (VTE). Endothelial receptor protein C is a transmembrane protein, which is expressed in the endothelium of large vessels, binds protein C (PC) and enhances its activation. The involvment of EPCR in hemostasis suggests a possible role in the pathogenesis of VTE. Genetic abnormalities affecting the gene of thrombomodulin and th endothelial protein C receptor may be associated with disturbances in the protein C pathway and therefore associated with an increased risk for thrombotic events.The purpose of this study was to investigate the appearance of 127G/A and 1456G/T mutations in the TM gene and the appearance of the two most common polymorphisms in the EPCR gene, 4600A/G in exon 4 that predicts a substitution of Ser219 by Gly in the transmembrane region of EPCR and 4678G/C in the 3’-UT region, in young patients with thrombosis as well as their impact on the risk of VTE, on the age of the first thrombotic episode and recurrence. We recruited 84 patients aged 22-83, as well as a control group of 100 healthy individuals matched for age and sex. All individuals were Caucasians and completed a detailed questionnaire including data of personal and family history of thrombosis, malignancy and drug intake. The study was approved by the local ethics committee and all the subjects gave their informed consent. Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) was used for the identification of 127G/A and 1456G/T mutations in the TM gene and the 4600A/G and 4678G/C polymorphisms in EPCR gene (LightCycler 2.0 Instrument, Roche Diagnostics GmbH). Patients were also studied for hereditary thrombophilia [FV Leiden and FII G20210A, deficiency of natural inhibitors of coagulation (PrC, PrS, and AT)].The FV Leiden and FII G20210A mutations were assessed by PCR and reverse hybridization that concurrently detects these two mutations (FV-PTH SripAssay, VIENNALAB, AUSTRIA). Automated hemostasis analyzer BCS System (Siemens GmbH) was used to determine the activity of natural inhibitors of coagulation.In our study, it appears that 127G/A and 1456G/T mutations is not a common risk factor of VTE in the Greek population. As far as, EPCR polymorphisms is regarded, frequency of the EPCR 4600A/G and 4678G/C genotype was comparable in patients and controls (p=0.7 and p=0.5 respectively). However, in a subset analysis we observed that the EPCR 4600A/G genotype was more prevalent (69.3%) in patients who developed VTE earlier (<35) compared to older age groups. Moreover, the EPCR 4678C/C genotype confers a protective advantage for VTE in terms of age of first thrombotic manifestation.The insights gained from studies that evaluate the involvement of EPCR polymorphisms in the risk of VTE may not only elucidate underlying pathophysiological mechanisms but also their clinical significance and the interplay between these polymorphisms and other congenital and/or epigenetic risk factors. Further studies including larger number of patients as well as detection of EPCR levels are required in order to clarify the implication, if any, of these polymorphisms in the pathogenesis of VTE.

Το μονοπάτι της πρωτεΐνη C παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του σχηματισμού ινώδους. Η ομαλή ροή εξαρτάται από την ακριβή δέσμευση, στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων, της θρομβίνης (T), της θρομβομοντουλίνης (TM), της πρωτεΐνης C (PC) και του ενδοθηλιακού υποδοχέα της πρωτεΐνης C (EPCR). Η ΤΜ αποτελεί έναν σημαντικό συμπαράγοντα στο μονοπάτι της πρωτεΐνης C, καθώς είναι ενδοθηλιακός υποδοχέας της θρομβίνη που διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της πήξης του αίματος, μειώνοντας την δραστηριότητα της θρομβίνης και ενισχύοντας την ενεργοποίηση της PC. Η σάρωση του γονίδιου της TM σε ασθενείς που έχουν παρουσιάσει ένα ή περισσότερα θρομβωτικά επεισόδια έχει αποκαλύψει αρκετές μεταλλάξεις και/ή πολυμορφισμούς, μερικοί από τους οποίους σχετίζονται με φλεβική θρόμβωση. Ο EPCR είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη που εκφράζεται στο ενδοθήλιο των μεγάλων αγγείων, δεσμεύει την PC και ενισχύει την ενεργοποίηση της. Η εμπλοκή του EPCR στον μηχανισμό της αιμόστασης υποδηλώνει έναν πιθανό ρόλο στην παθογένεια της φλεβικής θρόμβωσης (ΦΘΕ). Γενετικές ανωμαλίες που επηρεάζουν το γονίδιο της ΤΜ και του EPCR ενδεχομένως να σχετίζονται με διαταραχές στο μονοπάτι της PC και κατά συνέπεια να συνδέονται με αυξημένο κίνδυνο για θρομβωτικά επεισόδια.Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί η παρουσία των μεταλλάξεων 127G/A και 1456G/T στο γονίδιο της TM και των δύο πιο κοινών πολυμορφισμών στο γονίδιο του EPCR (του πολυμορφισμού 4600A/G στο εξώνιο 4 που οδηγεί σε υποκατάσταση Ser219Gly στην διαμεμβρανική περιοχή του EPCR και του πολυμορφισμού 4678G/C στην 3' μη μεταφραζόμενη περιοχή του EPCR σε ασθενείς που έχουν παρουσιάσει μια ή/και περισσότερες θρομβοεμβολικές επιπλοκές όπως Πνευμονική Εμβολή, εν τω βάθει φλεβική θρόμβωση, αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο και έμφραγμα του μυοκαρδίου σε νεαρή ηλικία με τελικό στόχο τη διερεύνηση της μοριακής βάσης θρομβοφιλικής διάθεσης άγνωστης μέχρι στιγμής αιτιολογίας, καθώς επίσης εκτίμηση του κινδύνου εμφάνισης φλεβικής θρομβοεμβολής σε άτομα τα οποία φέρουν αυτές τις μεταλλάξεις σε συνδυασμό με ήδη γνωστές μεταλλάξεις ή/ και άλλους παράγοντες κινδύνου. Διεξήχθη μελέτη στην οποία συμπεριλαμβάνονταν 84 ασθενείς και 100 υγιή άτομα ως ομάδα ελέγχου. Για την ανίχνευση των παραπάνω μεταλλάξεων και πολυμορφισμών στον ελληνικό πληθυσμό εφαρμόστηκε η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real-Time PCR). Με την τεχνική αυτή, μας δίνεται η δυνατότητα προσδιορισμού της παρουσίας ή απουσίας μεταλλάξεων με απώτερο σκοπό τη διερεύνηση της μοριακής βάσης θρομβοφιλικής διάθεσης άγνωστης μέχρι στιγμής αιτιολογίας. Επίσης, έγινε συγκριτικός έλεγχος του προσδιορισμού των πολυμορφισμών 4600A/G και 4678G/C στο γονίδιο του EPCR με τη μέθοδο του ανάστροφου υβριδισμού.Πραγματοποιήθηκε, ακόμη, προσδιορισμός των κύριων μεταλλάξεων που σχετίζονται με εμφάνιση φλεβικής θρόμβωσης, της μετάλλαξης FVLeiden και του πολυμορφισμού G20210A στο γονίδιο της προθρομβίνης (FII), στους ασθενείς και στην ομάδα ελέγχου, με τη μέθοδο του ανάστροφου υβριδισμού, με σκοπό την διερεύνηση της παρουσίας γενετικής προδιάθεσης και εκτίμησης του κινδύνου ΦΘΕ σε άτομα τα οποία φέρουν αυτές τις μεταλλάξεις σε συνδυασμό με νέες μεταλλάξεις/πολυμορφισμούς. Τέλος, διεξήχθη προσδιορισμός δραστικότητας των φυσικών ανασταλτών της πήξης, πρωτεϊνών C, S και AT, στο δείγμα των ασθενών, με τον αυτοματοποιημένο αναλυτή πήξη BCS System, έτσι ώστε να γίνει έλεγχος θρομβοφιλικής προδιάθεσης στα πλαίσια διερεύνησης της μοριακής βάσης συγγενούς ανεπάρκειας των παραπάνω παραγόντων του μονοπατιού της πρωτεΐνης C και του μονοπατιού της πήξης. Παρατηρήθηκε ότι οι μεταλλάξεις 127G/A και 1456G/T δεν είναι συχνές στον ελληνικό πληθυσμό και ως εκ τούτου δεν είναι πιθανό να αποτελούν συνήθεις παράγοντες κινδύνου για φλεβική θρόμβωση. Η συχνότητα του γονότυπου EPCR 4600A/G και 4678G/C βρέθηκε συγκρίσιμη στην ομάδα ασθενών και στην ομάδα ελέγχου (ρ=0.7 και ρ=0.5 αντίστοιχα). Ωστόσο, σε μια υπό-ανάλυση παρατηρήθηκε ότι ο γονότυπος EPCR 4600A/G ήταν πιο συχνός (69,3%) σε ασθενείς που ανέπτυξαν ΦΘΕ σε νεαρή ηλικία (<35) σε σύγκριση με τις μεγαλύτερες ηλικιακές ομάδες (p=0.001). Επιπλέον, ο γονότυπος EPCR 4678C/C φαίνεται ότι προσδίδει προστατευτικό πλεονέκτημα έναντι ΦΘΕ όσον αφορά την ηλικία εμφάνισης πρώτου επεισοδίου. Οι περιορισμοί που σχετίζονται από τον μικρό αριθμό ασθενών δεν μας επιτρέπουν να προβούμε σε οριστικά αποτελέσματα αλλά μόνο να προτείνουμε πιθανές αλληλεπιδράσεις. Περισσότερες μελέτες που να αφορούν ένα μεγαλύτερο αριθμό ασθενών, καθώς και ανίχνευση των επιπέδων του sEPCR απαιτούνται προκειμένου να αποσαφηνιστεί η επίπτωση, εάν και εφόσον υπάρχει, αυτών των πολυμορφισμών στην παθογένεια της ΦΘΕ.