Μελέτη γονιδίων που ευθύνονται για την εμφάνιση και εξέλιξη του ιδιοπαθούς νεφρωσικού συνδρόμου καθώς και της νεανικής υπερουριχαιμικής νεφροπάθειας και της μυελώδους κυστικής νόσου τύπου ΙΙ

Abstract

Idiopathic nephrotic syndrome is the most common glomerular disease in children. Until now, several genes have been identified. Mutations of these genes are responsible for the occurrence of nephrotic syndrome. Nephroblastoma is the most common infantile cancer of the kidneys. Mutations in the WT1 gene are observed in 20% of Wilms tumor cases. Another group of kidney diseases consists of Familial Juvenile Hyperuricaemic Nephropathy(FJHN) and Medullary Cystic Kidney Disease Type II(MCKD2). Studies have shown that the majority of patients have mutations in exons 4 and 5 of the uromodulin gene (UMOD). The aim of this thesis is the detection of mutations in the genes that are related with idiopathic nephrotic syndrome, nephroblastoma as well as uromodulin –related diseases of the nephron. In this study we included three different groups of patients. Group A has 43 patients with nephrotic syndrome. Group B consists of 9 cases diagnosed with nephroblastoma and Group Γ consists with 11 patients diagnosed with FJHN/MCKD2.The main method used in this study is sequencing. Primers were designed for the exons of NPHS1, TRPC6 and PLCE1. Primers were designed for the seven of the ten exons of WT1 and the exon 4 of the UMOD. In Group A, the analysis of NPHS1 revealed two patients carrying mutations that could explain their phenotype and 5 patients carrying heterozygous mutations. Analysis of the PLCE1 gene revealed 4 patients with homozygous mutations that could explain their phenotype. In both genes, new substitutions were detected. Different in silico programs were used as to define their effect in the protein, even though further study is required as to obtain more information. No mutations were found in the TRPC6 gene. In Group B analysis of the WT1 revealed mutations in 4 of the 9 cases. In Group Γ, no mutations were found in the analysis of the exon 4 of the UMOD gene.In conclusion, the screening of mutation in the genes involved in the pathogenesis of the nephrotic syndrome represents a major factor for the progress as well as the therapeutic approach of these patients. The quest for different genetic loci and mechanisms involved in the pathogenesis of nephrotic syndrome could result in a better pharmaceutical management of these patients, family planning, as well as their therapy using new pharmaceutical targets. Concerning patients with nephroblastoma, screening for mutations could result in a better treatment as well as prevention of their disease. Concerning the UMOD gene, further analysis must be made to the rest of the exons. Also it is necessary to screen different genes involved in the development of FJHN/MCKD2.

Το ιδιοπαθές νεφρωσικό σύνδρομο αποτελεί την πιο κοινή σπειραματική ασθένεια στα παιδιά. Μέχρι. σήμερα, έχουν ταυτοποιηθεί αρκετά γονίδια μεταλλάξεις των οποίων είναι υπεύθυνες για την εμφάνιση του νεφρωσικού συνδρόμου. Το νεφροβλάστωμα αποτελεί την πιο κοινή μορφή νεανικού καρκίνου στα νεφρά. Μεταλλάξεις στο γονίδιο WT1 είναι υπεύθυνες για την εμφάνιση νεφροβλαστώματος σε ποσοστό 20%. Μια άλλη ομάδα ασθενειών του νεφρού είναι η οικογενής νεανική υπερουριχαιμική νεφροπάθεια (Familial Juvenile Hyperuricaemic Nephropathy/FJHN) και η μυελώδης κυστική νόσος των νεφρών τύπου ΙΙ (Medullary Cystic Kidney Disease Type II/MCKD2). Μελέτες έδειξαν πως η πλειοψηφία των ασθενών εμφανίζουν μεταλλάξεις στα εξόνια 4 και 5 του γονιδίου της ουρομουντολίνης (UMOD). Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει ως σκοπό την ανίχνευση μεταλλάξεων στα γονίδια που σχετίζονται με το ιδιοπαθές νεφρωσικό σύνδρομο, το νεφροβλάστωμα καθώς και στις FJHN/MCKD2. Υλικό της μελέτης αποτέλεσαν τρεις διαφορετικές ομάδες ασθενών. Στην ομάδα Α περιλήφθησαν 43 ασθενείς με νεφρωσικό σύνδρομο. Η ομάδα Β αποτελείται από 9 ασθενείς με διάγνωση νεφροβλαστώματος και η ομάδα Γ αποτελείται από 11 ασθενείς με διάγνωση FJHN/MCKD2.Η μεθοδολογία βασίστηκε στην χρήση της ανάλυσης της πρωτοταγούς δομής του DNA. Πραγματοποιήθηκε σχεδιασμός των εκκινητών των εξονίων του γονιδίου NPHS1, του TRPC6 και της PLCE1 για το νεφρωσικό σύνδρομο. Για το νεφροβλάστωμα πραγματοποιήθηκε σχεδιασμός εκκινητών για 7 από τα 10 εξόνια του γονιδίου WT1. Όσον αφορά το γονίδιο UMOD σχεδιάστηκαν εκκινητές για το εξόνιο 4. Από τη μελέτη διαπιστώθηκε ότι δύο ασθενείς της ομάδας Α έφεραν παθολογικές μεταλλάξεις στο γονίδιο NPHS1 καθώς και 5 ασθενείς της ίδιας ομάδας με ετερόζυγες μεταλλάξεις. Η ανάλυση του γονιδίου PLCE1 ανέδειξε 4 ασθενείς με ομόζυγες μεταλλάξεις οι οποίες μπορούσαν να εξηγήσουν τον κλινικό φαινότυπο των ασθενών. Στα γονίδια NPHS1 αλλά και PLCE1 ανιχνεύθηκαν νέες αντικαταστάσεις. Για την επίδραση των αντικαταστάσεων αυτών χρησιμοποιήθηκαν διάφορα in silico προγράμματα, αν και κρίνεται απαραίτητη η περαιτέρω μελέτη των αλλαγών αυτών για τη διευκρίνηση τους. Στο γονίδιο TRPC6 δεν ανιχνεύθηκαν μεταλλάξεις. Η ανάλυση του γονιδίου WT1 στο νεφροβλάστωμα είχε ως αποτέλεσμα την ανίχνευση μεταλλάξεων σε 4 από τα 9 περιστατικά της ομάδας Β. Ο έλεγχος του εξονίου 4 της ουρομουντολίνης δεν οδήγησε στην ταυτοποίηση μεταλλάξεων σε κανένα ασθενή της ομάδας Γ.Συμπερασματικά, η ανίχνευση μεταλλάξεων σε ασθενείς με νεφρωσικό σύνδρομο αποτελεί ένα σημαντικό παράγοντα για την εξέλιξη αλλά και τη θεραπευτική προσέγγιση τους. Η αναζήτηση επιπλέον γονιδιακών τόπων που εμπλέκονται στη παθογένεια του νεφρωσικού συνδρόμου μπορεί να οδηγήσει σε καλύτερη φαρμακευτική προσέγγιση, στη δυνατότητα οικογενειακού προγραμματισμού αλλά και ίσως στη θεραπεία τους με τη χρήση νέων φαρμακευτικών στόχων. Επιπλέον, η ανίχνευση μεταλλάξεων σε ασθένειες με νεφροβλάστωμα δίνει τη δυνατότητα για τον καθορισμό καλύτερης πρόγνωσης ως προς την εξέλιξη αλλά και θεραπεία της νόσου. Όσον αφορά το γονίδιο UMOD πρέπει να πραγματοποιηθεί έλεγχος των υπόλοιπων εξονίων του γονιδίου UMOD.