Ο αναδυόμενος ρόλος των ουδετερόφιλων στη φλεγμονώδη απόκριση

Abstract

Neutrophils or polymorphonuclear neutrophils (PMNs) are the largest population of white blood cells and play key role in the innate immunity. Recently, it was described a new additional antimicrobial mechanism of neutrophils “neutrophil extracellular traps (NETs)”.In the present work we addressed the emerging role of neutrophils in the inflammatory response in two inflammatory models, a sterile inflammation and an infective one. Model I assessed the role of neutrophils in Acute Coronary Syndrome, and Model II the immunomodulatory role of antibiotics as inducers of NETs and their antimicrobial activity against multi-drug resistant strains. We hypothesized that endothelial damage during the rupture of atherosclerotic plaques induces the NET formation and the exposure of functional TF on NETs. It was found that neutrophils where the predominant cell population in the Infarct Related Artery (IRA) of patients with STEMI. Moreover, ex vivo experiments, demonstrated that neutrophils from the IRA artery, release NETs more often, in comparison to neutrophils from non IRA (coronary or a peripheral artery) of the same patient. Furthermore, it was found that neutrophils of STEMI patients produce tissue factor (TF). Also IRA, non IRA and circulating neutrophils of STEMI patients expressed TF. Moreover, neutrophils from IRA generated NETs, enriched with TF. Subsequently, the effect of plasma IRA on healthy neutrophils, was studied. In vitro stimulation of healthy PMNs with plasma obtained from IRA induced intracellular up-regulation of TF, but not NETs formation. In addition, platelets from IRA artery were capable to induce NETs formation. Moreover, we demonstrate that plasma from IRA artery activate platelet in vitro. With the above findings it is hypothesized that for NETs generation and their subsequent TF expression, it is required an interactive process between PMNs and thrombin-activated platelets.In summary, the results of this study, demonstrate the complementary role of plasma and platelets in the formation of NETs enriched with TF. All of these findings support the leading role of neutrophils in the cross talk of thrombosis and inflammation. Furthermore, the immunomodulatory role of macrolides was studied. Initially, it was investigated the ability of antibiotics to induce NET formation. Macrolides induced NET formation in vitro and ex vivo. The clarithromycin-induced NETs expressed the LL-37 protein.A.baumannii strains are resistant to macrolides. The antimicrobial activity of clarithromycin-induced NETs, against A.baumannii was studied and it was ascertained for multiresistant strains of A. baumannii, in vitro and ex vivo. Furthermore, it was also found out that clarithromycin-induced NETs are able to inhibit the formation of biofilm via LL-37. The present study demonstrates the leading role of neutrophils in the inflammatory response. Moreover, it proposes other mechanisms of action for the “old players” with possible goals of therapeutic intervention.

Τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα αποτελούν τον κυρίαρχο πληθυσμό των λευκών αιμοσφαιρίων και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη φλεγμονώδη απόκριση. Η ανακάλυψη του μηχανισμού απελευθέρωσης των εξωκυττάριων ουδετεροφιλικών δικτύων χρωματίνης (ΝΕΤ) αποτέλεσε την ώθηση για πληθώρα μελετών.Στη παρούσα διατριβή, ο ρόλος των ουδετεροφίλων στη φλεγμονώδη απόκριση μελετήθηκε σε δύο μοντέλα φλεγμονής: Ι) ο ρόλος των ουδετερόφιλων στο Οξύ Στεφανιαίο Σύνδρομο, ως αντιπροσωπευτικό μοντέλο άσηπτης φλεγμονής και ΙΙ) ο ανοσοτροποποιητικός ρόλος των αντιβιοτικών με το σχηματισμό ΝΕΤs και την συνεπακόλουθη αντιμικροβιακή τους δράση κατά πολυανθεκτικών στελεχών. Διαπιστώθηκε ότι τα ουδετερόφιλα αποτελούν κυρίαρχο κυτταρικό πληθυσμό και δημιουργούν τα NETs στη προσβεβλημένη στεφανιαία αρτηρία (Infract Related Artery- IRA) ασθενών με οξύ έμφραγμα μυοκαρδίου (ST elevation myocardial infraction: STEMI). Επιπλέον, σε ex vivo πειράματα, σε ασθενείς με STEMI, παρατηρήθηκε ότι τα ουδετερόφιλα που προέρχονταν από IRA, απελευθερώνουν ΝΕΤs πολύ περισσότερο σε σύγκριση με ουδετερόφιλα από μη προσβεβλημένη στεφανιαία αρτηρία (non IRA), καθώς και με ουδετερρόφιλα από περιφερική αρτηρία. Στη συνέχεια, καταδείχθηκε ότι τα ουδετερόφιλα ασθενών με STEMI, παράγουν τον TF. Επιπρόσθετα, τα ουδετερόφιλα από IRA, σχηματίζουν τα ΝΕΤs, πάνω στα οποία εκφράζουν και τον TF. Στη συνέχεια, η έρευνα στράφηκε σε in vitro μοντέλο για τη μελέτη της επίδρασης του πλάσματος, IRA και non-IRA προέλευσης, στα ουδετερόφιλα υγιών ατόμων και ιδιαίτερα στην έκφραση του TF και στην επαγωγή της ΝΕΤωσης. Η διέγερση των ουδετερόφιλων με πλάσμα (IRA ή non IRA), έδειξε αύξηση της ενδοκυττάριας έκφρασης του TF. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματά αυτά αποδεικνύουν την απαραίτητη συμμετοχή του πλάσματος και των αιμοπεταλίων στο σχηματισμό των ΝΕΤs, με έκφραση του TF. Το σύνολο των φαινομένων αυτών φαίνεται ότι αποτελεί έναν μηχανισμό με τον οποίο τα ουδετερόφιλα παίζουν πρωταγωνιστικό ρόλο σε θρομβωτικές διαδικασίες. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, το ενδιαφέρον στράφηκε στη μελέτη της ανοσοτροποποιητικής δράσης των μακρολίδων. Αρχικά, διερευνήθηκε η ικανότητα των αντιβιοτικών να επάγουν την ΝΕΤωση. Παρατηρήθηκε ότι οι μακρολίδες επάγουν τη ΝΕΤωση in vitro και ex vivo. Στη συνέχεια, η μελέτη των πρωτεϊνικών συστατικών, των επαγόμενων από την κλαριθρομυκίνη ΝΕΤs, κατέδειξε την έκφραση του αντιμικροβιακού πεπτιδίου LL-37. Στο τελευταίο μέρος της παρούσας μελέτης, διερευνήθηκε η αντιμικροβιακή δράση των επαγόμενων από την κλαριθρομυκίνη ΝΕΤs κατά των στελεχών του A.baumannii. Διαπιστώθηκε ότι τα ΝΕΤs αυτά έχουν άμεση αντιμικροβιακή δράση τόσο in vitro όσο και ex vivo. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι τα ΝΕΤs αναστέλλουν τον σχηματισμό των βιομεμβρανών από τα στελέχη του A.baumannii. Η έκφραση της LL-37 πρωτεΐνης στα NETs ήταν καθοριστική για την δράση αυτή.Η συμμετοχή των ουδετεροφιλικών αντιμικροβιακών πεπτιδίων στην αντιμετώπιση των λοιμώξεων οφειλόμενων στα πολυανθεκτικά στελέχη, αποτελεί ένα σημαντικό πεδίο έρευνας, που στοχεύει στην ανίχνευση νέων θεραπευτικών μορίων. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής φανερώνουν το πρωταγωνιστικό ρόλο των ουδετεροφίλων στη φλεγμονώδη απόκριση και προτείνουν νέους μηχανισμούς κυτταρικής συνομιλίας στη φλεγμονή και ίσως αναδεικνύουν νέους θεραπευτικούς στόχους.