Μελέτη του ρόλου των ιστικών καλλικρεϊνών 7 και 14 στον καρκίνο του παχέος εντέρου

Abstract

Colon or colorectal cancer constitutes the third leading cause of cancer death in menand women in the U.S.A. and it is generally one of the prevalent cancer types in westernindustrialized countries. Human tissue kallikreins (KLKs) form a subfamily of 15 secretedserine proteases, which are encoded by 15 structurally similar genes that colocalize intandem on chromosome 19q13. KLKs are localized primarily in the cytoplasm of glandularepithelia, from which they are secreted. A plethora of studies have shown that kallikreinexpression on the mRNA and/or protein levels is deregulated in cancer and it has beencorrelated with prognosis, so kallikrein proteases have been proposed as promising noveltumor biomarkers or as potential therapeutic targets.Human tissue kallikrein-related peptidase 7 (KLK7) is a secreted serine protease withchymotrypsin-like specificity. KLK7 gene transcription produces 4 alternative mRNA splicevariants that differ due to the absence of intermediate coding exons and the structure of5΄ and 3΄untranslated regions. The mature enzyme participates in the proteolytic cascadeof normal skin desquamation, as well as in epithelial to mesenchymal transition andcleavage of extracellular matrix components during cancer progression. KLK7 geneexpression has been correlated with unfavorable prognosis in breast, ovarian, cervical,brain and colon cancer, but with favorable prognosis in lung adenocarcinoma.Human tissue kallikrein-related peptidase 14 (KLK14) is a secreted serine proteasewith dual specificity, trypsin- and chymotrypsin-like. KLK14 gene is transcribed into a single mRNA transcript. Normally, KLK14 participates in proteolytic cascades duringdesquamation of the stratum corneum, together with KLK7, and semen liquefaction, aswell as in extracellular matrix protein degradation and cleavage of insulin-like growthfactor binding proteins (IGFBPs) during tumor growth, invasion and metastasis. KLK14gene expression has been correlated with poor prognosis in breast, ovarian and prostatecancer.The aim of the present thesis was the analysis and clinical evaluation of theexpression of KLKs 7 and 14 at the mRNA and protein levels in cancerous and noncancerouscolon tissues, the study of KLKs 7 and 14 mRNA transcript variants in coloncancer cell lines and tissues, as well as the investigation of their biological role in coloncancer.KLK7 and KLK14 mRNA expression was quantitatively assessed in cancer, normal andadenomatous colon tissues. There is significantly higher mRNA expression of KLK7 andKLK14 in cancer tissues than normal ones (p<0.001 and p=0.035, respectively), as well asin cancer tissues compared to adenomas (p<0.001 for both of them). mRNA expressionlevels of both genes have discriminatory value between cancer and adenoma tissues(AUC=0.669 for KLK7 and AUC=0.708 for KLK14, p<0.001 for both), with KLK14 obtaininggreater distinguishing power. Moreover, both genes were shown to be fairly co-expressedin all three types of colon tissues examined (normal rs=0,667, p<0,001, adenomasrs=0.373, p=0.001, carcinomas rs=0,478, p<0.001), thus their expression is deregulated incancer in a coordinated manner. High mRNA expression of KLK7 and KLK14 is statisticallysignificantly associated with positive nodal status (p=0.015 and p=0.019, respectively), aswell as more advanced TNM stage of the disease (p=0.004 and p=0.043, respectively).KLK14 high mRNA expression is significantly associated with shorter disease-free (DFS)and overall survival (OS) of cancer patients (p=0.003 και p=0.016, respectively), whereasKLK7 high mRNA expression is significantly associated only with shorter DFS (p=0.004).Therefore, KLK7 and KLK14 gene expression could be regarded as candidate markers ofunfavorable prognosis for colon cancer patients, nevertheless not independent.KLK7 and KLK14 protease expression was immunohistochemically evaluated inparaffin-embedded colon cancer, adenoma and normal tissues. Localization pattern ofKLK7 and KLK14 proteins is primarily similar in all three types of tissue examined. There is no immunostaining in normal epithelial cells for none of the two KLKs, except for someslight KLK14 immunostaining observed in stromal cells. Βoth proteases are intenselyexpressed in neoplastic glandular epithelia, adenomatous or cancerous, especiallytowards the luminal surface and in the secretions, which confirms their secretory nature.Their cellular localization is cytoplasmic, homogeneous for KLK7 but granular for KLK14.Survival analysis demonstrated that KLK7 expression is a significant independent indicatorof poor prognosis for DFS (p=0.02) and marginally for OS (p=0.054) of colon cancerpatients, whereas KLK14 expression was not found to be associated with survival time.KLK7 and KLK14 mRNA transcript variants were detected in colon cancer cells lines(HT-29, HCT 116, DLD-1, Caco2, LS 180) and cDNA pools from tissues classified accordingto histological type. KLK7 splice variants 1, 2 and 3 are expressed in cell lines and cDNApools, whereas KLK7 variant 4 was not detected. KLK7 splice variants 1 and 2, whichproduce the same functional protein isoform, showed increased expression in adenomasand cancer. On the contrary, KLK7 splice variant 3, which produces a protein withoutserine protease activity, showed its higher expression in normal tissues and a gradualdecrease and loss during the course of the disease, possibly exhibiting a physiologicalregulatory role. The single KLK14 mRNA transcript is intensely expressed in cell lines,except Caco2, in which it was slightly detected. KLK14 mRNA transcript showed its higherexpression in adenoma cDNA pool, while in the following stages of the disease it was notintensely increased compared to normal tissue. This transcript may play a role in the earlytumorigenesis. In cell lines, except Caco2, and in certain cDNA pools, a new shorter thanthe classical KLK14 mRNA isoform was detected, lacking the intermediate coding exon 5.KLK7 gene expression silencing with the use of small interfering RNAs (siRNAs)resulted in a 50% decrease of the invasive capacity of HCT 116 colon cancer cells toinfiltrate GFR MatrigelTM membrane (p=0.016). Likewise, KLK14 gene expression silencingwith siRNAs resulted in a particularly high 80% decrease of the invasive capacity of DLD-1colon cancer cells to infiltrate GFR MatrigelTM membrane (p=0.006). Therefore, KLK7 andKLK14 expression is associated with the invasive capacity of colon cancer cells in vitro byenhancing their metastatic phenotype, but without any impact on their proliferativeability. KLK7 gene silencing with siRNAs altered the protein profile of HCT 116.colon cancercells, as demonstrated by Proteomic analysis. Among proteins with very significant(p<0.01) decreased expression after KLK7 knockdown, were two members of the heatshock protein family, HSP90B1 and HSPA4, which are implicated in cellular stressresponse, as well as the transcription co-factoy TRIM28. On the other hand, majorincrease was observed in the expression of anti-apoptotic protein ANP32B and twomembers of the annexin protein family, ANXA1 and ANXA3, which are deregulated incancer and have been correlated with tumor growth, invasion and metastasis.In conclusion, kallikrein-related peptidases 7 and 14 are significantly upregulated incolon adenomas and cancer, their expression is coordinately altered during the course ofthe disease and correlated with advanced TNM stage and nodal invasion, as well as withpatients’ survival time. They can contribute to prognosis, but not as independent factors.They are localized in the cytoplasm of epithelial cells of adenomas and adenocarcinomasfrom which they are secreted and their over-expression significantly enhances theinvasive and metastatic potential of cancer cells.

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου ή ορθοκολικός καρκίνος αποτελεί την τρίτη αιτίαθανάτου από καρκίνο τόσο στους άντρες όσο και στις γυναίκες στις Η.Π.Α. και είναι έναςαπό τους κυρίαρχους τύπους καρκίνου στις δυτικές βιομηχανοποιημένες χώρες. Οιανθρώπινες ιστικές καλλικρεΐνες (KLKs) αποτελούν μια υποοικογένεια 15 εκκρινόμενωνπρωτεασών σερίνης, οι οποίες κωδικοποιούνται από 15 δομικά όμοια γονίδια πουεδράζονται σε στενή διαδοχή στο χρωμόσωμα 19q13.4. Κύρια θέση εντόπισής τους είναιτο κυτταρόπλασμα των αδενικών επιθηλιακών κυττάρων, από όπου εκκρίνονται.Πληθώρα μελετών έχει δείξει ότι η έκφραση των καλλικρεϊνών σε επίπεδο mRNA ή/καιπρωτεΐνης απορρυθμίζεται στον καρκίνο και έχει συσχετιστεί με την πρόγνωση, γι’ αυτόοι καλλικρεΐνες έχουν προταθεί ως νέοι υποσχόμενοι βιοδείκτες καρκίνου ή ως πιθανοίθεραπευτικοί στόχοι.Η ανθρώπινη ιστική καλλικρεΐνη 7 (KLK7) είναι μια εκκρινόμενη πρωτεάση σερίνηςμε ειδικότητα χυμοθρυψίνης. Η μεταγραφή του γονιδίου KLK7 παράγει 4 εναλλακτικάmRNA μετάγραφα, που διαφέρουν μεταξύ τους ως προς την έλλειψη ενδιάμεσωνκωδικών εξωνίων και τη δομή των 5΄ και 3΄ αμετάφραστων περιοχών τους. Το ώριμοένζυμο συμμετέχει στον πρωτεολυτικό καταρράκτη αντιδράσεων κατά τη φυσιολογικήαπολέπιση του δέρματος, αλλά και στη μετάβαση από επιθήλιο σε μεσέγχυμα και στηνπέψη συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας κατά την καρκινογένεση. Η ανθρώπινη ιστική καλλικρεΐνη 14 (KLK14) είναι εκκρινόμενη πρωτεάση σερίνης μεδιττή ειδικότητα, θρυψίνης και χυμοθρυψίνης. Το γονίδιο KLK14 μεταγράφεταιπαράγοντας ένα μοναδικό mRNA μετάγραφο. Φυσιολογικά, συμμετέχει στουςπρωτεολυτικούς καταρράκτες της απολέπισης της κεράτινης στιβάδας του δέρματος μαζίμε την KLK7 και της ρευστοποίησης του σπέρματος, αλλά και στην αποδόμησηπρωτεϊνών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και στη διάσπαση πρωτεϊνών πουδεσμεύουν τους αυξητικούς παράγοντες τύπου ινσουλίνης (IGFBPs) κατά την ανάπτυξη,τη διήθηση και τη μετάσταση του καρκίνου.Σκοπός της παρούσας Διατριβής είναι η ανάλυση και η κλινική αξιολόγηση τηςέκφρασης των γονιδίων KLK7 και KLK14 σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης τόσο σεκαρκινικούς και όσο και σε μη καρκινικούς ιστούς παχέος εντέρου, η μελέτη των mRNAμεταγράφων των δυο γονιδίων σε καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου καιιστούς, καθώς και η διερεύνηση του βιολογικού τους ρόλου στον καρκίνο του παχέοςεντέρου.Η συνολική έκφραση mRNA των γονιδίων KLK7 και KLK14 προσδιορίστηκε ποσοτικάσε καρκινικούς, φυσιολογικούς και αδενωματώδεις ιστούς παχέος εντέρου. H έκφρασηmRNA των KLK7 και KLK14 είναι σημαντικά αυξημένη στον καρκίνο σε σύγκριση με τοφυσιολογικό ιστό (p<0,001 και p=0,035, αντίστοιχα), όπως επίσης και στον καρκίνο σεσύγκριση με τα αδενώματα (p<0,001 και για τα δυο). Τα επίπεδα έκφρασής τους δίνουντη δυνατότητα διάκρισης μεταξύ καρκινικού και αδενωματώδους ιστού (AUC=0,669 γιατο KLK7 και AUC=0,708 για το KLK14, p<0,001 και για τα δυο), με την έκφραση mRNA τουKLK14 να έχει πιο ισχυρή διακριτική ικανότητα. Επίσης, δείχθηκε ότι τα δυο γονίδια συν-εκφράζονται σε μέτριο βαθμό και στους τρεις τύπους ιστού που εξετάστηκαν(φυσιολογικοί ιστοί rs=0,667, p<0,001; αδενώματα rs=0,373, p=0,001; καρκινώματαrs=0,478, p<0,001), οπότε η έκφρασή τους απορρυθμίζεται συγχρονισμένα στον καρκίνο.H υψηλή έκφραση mRNA του KLK7 και του KLK14 σχετίζεται στατιστικά σημαντικά με τηδιήθηση στους λεμφαδένες (p=0,015 και p=0,019, αντίστοιχα) και με προχωρημένοστάδιο ΤΝΜ της νόσου (p=0,004 και p=0,043, αντίστοιχα). Η υψηλή έκφραση mRNA τουKLK14 σχετίζεται σημαντικά με μικρότερο χρόνο ελεύθερης νόσου (DFS) και ολικής (OS)επιβίωσης (p=0,003 και p=0,016, αντίστοιχα) των ασθενών με καρκίνο, ενώ η υψηλήέκφραση mRNA του KLK7 βρέθηκε να σχετίζεται σημαντικά μόνο με συντομότερη DFS επιβίωση (p=0,004). Συνεπώς, η έκφραση mRNA τόσο του KLK7 όσο και του KLK14 θαμπορούσε να αποτελέσει υποψήφιο δείκτη δυσμενούς πρόγνωσης για τους ασθενείς μεκαρκίνο στο παχύ έντερο, ωστόσο αλλά κανένας από τους δυο πιθανούς δείκτες δενείναι ανεξάρτητος.Προσδιορίστηκε ανοσοϊστοχημικά η έκφραση των πρωτεασών KLK7 και KLK14 σετομές παραφίνης καρκινικών, φυσιολογικών και αδενωματωδών ιστών παχέος εντέρου.Το πρότυπο εντόπισης των KLK7 και KLK14 εμφανίζει κατά βάση μεγάλη ομοιότητα στατρία είδη ιστού που εξετάστηκαν. Δεν παρατηρήθηκε έκφραση των δυο πρωτεασών σταφυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα, εκτός από κάποια ασθενή χρώση της KLK14 σεστρωματικά κύτταρα. Αντίθετα, στα νεοπλασματικά αδενικά επιθήλια, αδενωματώδη ήκαρκινικά, και οι δυο πρωτεάσες εντοπίστηκαν με έντονη έκφραση, ιδιαίτερα προς τηναυλική επιφάνεια αλλά και στα εκκρίματα, εικόνα που συμβαδίζει με την εκκριτική τουςφύση. Η κυτταρική εντόπισή τους είναι κυτταροπλασματική, ομοιογενής για την KLK7 καικοκκιώδης για την KLK14. H ανάλυση επιβίωσης έδειξε ότι η έκφραση της KLK7 είναισημαντικός ανεξάρτητος δείκτης δυσμενούς πρόγνωσης για την DFS επιβίωση (p=0,02)και οριακά για την OS (p=0,054) των ασθενών, ενώ η έκφραση της KLK14 δεν βρέθηκε νααποτελεί σημαντικό προγνωστικό δείκτη για την επιβίωση.Τα εναλλακτικά mRNA μετάγραφα των γονιδίων KLK7 και KLK14 ανιχνεύτηκαν σεκαρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου (HT-29, HCT 116, DLD-1, Caco2, LS 180) καισε δεξαμενές cDNA από ιστούς παχέος εντέρου ταξινομημένους με βάση τον ιστολογικότους τύπο. Τα εναλλακτικά μετάγραφα 1, 2 και 3 του KLK7 εκφράζονται στις κυτταρικέςσειρές και στις δεξαμενές cDNA, ενώ το KLK7 μετάγραφο 4 όχι. Η έκφραση των KLK7μεταγράφων 1 και 2, των οποίων η μετάφραση παράγει την ίδια λειτουργική πρωτεΐνη,αυξάνεται στα αδενώματα και στον καρκίνο. Αντίθετα, η έκφραση του KLK7 μεταγράφου3, το οποίο πιθανώς μεταφράζεται σε πρωτεΐνη που δεν διαθέτει ενεργότητα πρωτεάσηςσερίνης, εμφανίζει την υψηλότερη τιμή της στη φυσιολογική δεξαμενή cDNA, ενώ κατάτην πορεία της καρκινικής εξαλλαγής βαθμιαία μειώνεται και τελικά χάνεται, οπότε ίσωςέχει κάποιο φυσιολογικό ρυθμιστικό ρόλο. Το KLK14 mRNA μετάγραφο εκφράζεταιέντονα στις κυτταρικές σειρές, εκτός της Caco2, στην οποία εκφράζεται ασθενώς. Στιςδεξαμενές cDNA, η έκφραση του KLK14 mRNA μεταγράφου παρουσιάζει την υψηλότερηαύξησή της στα αδενώματα, ενώ στην πορεία της νόσου εμφανίζεται ελαφρώς αυξημένη σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό. Ίσως το KLK14 μετάγραφο παίζει ρόλο στα αρχικάστάδια της νεοπλασίας. Στις καρκινικές κυτταρικές σειρές, εκτός της Caco2, και σεορισμένες δεξαμενές cDNA εντοπίστηκε ένα νέο KLK14 mRNA μετάγραφο μικρότερουμήκους από το κλασικό, από το οποίο απουσιάζει το ενδιάμεσο κωδικό εξώνιο 5.Μετά την αποσιώπηση της έκφρασης του KLK7 με τη χρήση μικρώνπαρεμβαλλόμενων μορίων RNA (siRNAs), διαπιστώθηκε μείωση της τάξης του 50% στηνικανότητα των καρκινικών κυττάρων παχέος εντέρου HCT 116 για διήθηση στουπόστρωμα GFR MatrigelTM (p=0,016). Ομοίως, μετά από καταστολή της έκφρασης τουKLK14 με τη χρήση siRNAs, διαπιστώθηκε ιδιαίτερα μεγάλη μείωση της τάξης του 80%στην ικανότητα των καρκινικών κυττάρων παχέος εντέρου DLD-1 να διηθούν τουπόστρωμα GFR MatrigelTM (p=0,006). Συνεπώς, η έκφραση των πρωτεασών KLK7 καιKLK14 συμβάλλει στο διηθητικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων παχέος εντέρου invitro ενισχύοντας τον μεταστατικό φαινότυπο, αλλά δεν βρέθηκε να έχει επίπτωση στορυθμό πολλαπλασιασμού τους.Η αποσιώπηση του γονιδιου KLK7 είχε ως αποτέλεσμα μεταβολή στο πρωτεϊνικόπροφίλ των καρκινικών κυττάρων HCT 116, όπως έδειξε η Πρωτεομική ανάλυση. Μεταξύτων πρωτεϊνών με πολύ σημαντική (p<0,01) μείωση της έκφρασής τους μετά τηνκαταστολή του KLK7 βρέθηκαν δυο μέλη της οικογένειας των πρωτεϊνών θερμικού σοκ(heat shock proteins), τα HSP90B1 και HSPA4, τα οποία ενέχονται στην απόκριση σεκυτταρικό στρες, καθώς και ο μεταγραφικός συμπαράγοντας TRIM28. Αντίθετα, τημέγιστη αύξηση έκφρασης εμφάνισε η αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη ANP32B και δυο μέλητης οικογένειας των αννεξινών, τα ΑΝΧΑ1 και ΑΝΧΑ3, τα οποία απορρυθμίζονται στονκαρκίνο και έχουν συσχετιστεί με την ανάπτυξη του όγκου, τη διήθηση και τη μετάσταση.Συμπερασματικά, οι KLK7 και KLK14 έχουν σημαντικά αυξημένη έκφραση στιςνεοπλασίες του παχέος εντέρου, μεταβάλλουν την έκφρασή τους συγχρονισμένα κατάτην πορεία της νόσου και σχετίζονται με προχωρημένο στάδιο ΤΝΜ και διήθηση στουςλεμφαδένες, αλλά και με την επιβίωση των ασθενών. Μπορούν να συμβάλλουν στηνπρόγνωση, αλλά όχι ως ανεξάρτητοι δείκτες. Εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα τωνεπιθηλιακών κυττάρων των αδενωμάτων και των αδενοκαρκινωμάτων, από όπουεκκρίνονται και η υπερ-έκφρασή τους ενισχύει σημαντικά το διηθητικό και μεταστατικόδυναμικό των καρκινικών κυττάρων.