Γονιδιωματική σύγκλιση για τον προσδιορισμό των υπεύθυνων γονιδίων για σύνθετα νοσήματα

Abstract

Diabetic nephropathy, a major microvascular complication of both type 1 diabetes mellitus (T1DM) and type 2 diabetes mellitus (T2DM), is an important cause of end-stage renal disease in Western nations. Despite the undoubted contribution of metabolic and hemodynamic factors in development and progression of the disease, growing evidence suggest the crucial role of genetic factors. Therefore, diabetic nephropathy is a multifactorial disease, the exact mechanisms of which remain unknown.The progress regarding the identification of the genetic architecture of the disease, including all the predisposing alleles, their frequency, the magnitude of their effect and their mode of inheritance, has proven very difficult. The reason is the identification of many predisposing alleles with small effect.Given the limited understanding of the genetic etiology of diabetic nephropathy, the current PhD dissertation aimed to identify the genetic variants that predispose to the disease. According to the methodological approach, molecular evidence-based medicine techniques were applied in available data from genetic linkage and genetic association studies.The multifactorial etiology of common disorders involving complex epistatic and gene-environment interactions reduces the likelihood that a single method could provide definitive answers. Alternatively, an integration approach combining different kinds of genetic data analysis (“genomic convergence”) has been proposed for the prioritization of promising results from the bulk of exponentially accumulating data. Evidence for the implication of a genetic locus can be considered as more valid when supported by independent research methodologies, such as linkage and association.In order to identify genetic loci linked to diabetic nephropathy, a meta-analysis of genome-wide linkage studies was performed. Methodologies developed in the Department of Biomathematics were applied for the performance of the meta-analysis. Meta-analysis has identified two novel cytogenetic locations not detected in individual scans (13q33.1-13q34, 17q24.3-17q25.3) and replicate the significance of four regions (7p22.3-7p15.3, 16p12.3-16q12.2, 21q22.11-21q22.3, 22q11.1-22q12.3) statistical significant in both weighted and unweighted analyses; however, only 22q11.1-22q12.3 reached genome-wide statistical significance.These genetic loci could merit prioritization in future studies, since further genotyping of these regions with additional markers and in extended pedigrees could contribute in the positional cloning of the responsible genes.In the field of the genetic association studies, a meta-analysis of all studies regarding genes that contribute in mechanisms of immune system was performed in order to investigate the contribution of immune system and inflammation in the pathogenesis of diabetic nephropathy. In all, 75 candidate genes of 6 KEGG pathways including 443 polymorphisms belonging to 103 studies were investigated, whereas 138 polymorphisms involved in qualitative synthesis of results. The main results of the meta-analysis is the predisposing role of polymorphisms of the CCL2, CCR5, IL6, IL8, EPO, IL1B, IL1O, IL1RN, GHRL, MMP9, TGFB1, VEGFA, MMP3, MMP12, IL12RB1, PRKCE, TNF, TNFRSF19 and IL1A in the development of diabetic nephropathy.Additionally, a field synopsis of the genetic association studies, both of candidate genes and GWAS, was performed regarding diabetic nephropathy. The main meta-analyses revealed a statistically significant predisposing role of 57 polymorphisms, of which 29 from analysis of genotypes and 28 of the analysis of alleles. These polymorphisms belong to 39 genes: , ACE, ADIPOQ, AGT, AKR1B1, APOC1, APOE, ATP1B2, ATP2A3, CARS, CCR5, CNDP1, EDN1, ENPP1, EPO, FLT4, GLO1, HMGA2, IGF2/INS/TH cluster, KCNQ1, KNG, LOC101927627, LOC105370358, MMP3, MMP12, MTHFR, NOS3, SDC2, SETD7, SIRT1, SLC12A3, SLC2A1, SLC2A2, TCF7L2, TGFB1, TIMP1, UNC13B, VEGFA and XYLT1, whereas last but not least 2 intergenic polymorphisms (rs1866813, rs4972593) should be taken into consideration in future studies.Additionally, the genomic convergence approach was applied in diabetic nephropathy studies with a genome-wide setting in order to identify genetic loci with concomitant and independent evidence of implication.

Η διαβητική νεφροπάθεια αποτελεί μια μικροαγγειακή επιπλοκή του σακχαρώδους διαβήτη, τόσο του τύπου Ι, όσο και του τύπου ΙΙ, συνιστώντας τη συχνότερη αιτία νεφρικής νόσου τελικού σταδίου στον Δυτικό κόσμο. Παρά την αδιαμφισβήτητη συμβολή μεταβολικών και αιμοδυναμικών παραγόντων που μέχρι πρότινος θεωρούνται οι κατεξοχήν υπεύθυνοι παράγοντες ανάπτυξης ΔΝ, σαφείς ενδείξεις υποδεικνύουν ότι κύριο ρόλο διαδραματίζει το γενετικό προφίλ των ατόμων. Συνεπώς, πρόκειται για νόσο με πολυπαραγοντική αιτιολογία, ως αποτέλεσμα της συνεργιστικής επίδρασης γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων, ο ακριβής μηχανισμός της οποίας παραμένει δυστυχώς άγνωστος μέχρι και σήμερα.Η πρόοδος όσον αφορά τον προσδιορισμό της υποκείμενης γενετικής αρχιτεκτονικής, δηλαδή του συνόλου των προδιαθεσικών αλληλόμορφων που υποκρύπτουν τη νόσο, το φάσμα της συχνότητας των αλληλόμορφων, το μέγεθος της επίδρασής τους και τον τρόπο κληρονόμησής τους, δεν αποδείχτηκε καθόλου εύκολη με την αντίληψη ότι ένα μόνο γονίδιο με μεγάλη επίδραση δεν υπάρχει. Έχουν προσδιοριστεί πολυάριθμα προδιαθεσικά αλληλόμορφα, το καθένα με μικρή επίδραση και τα οποία συνολικά συνεισφέρουν στην εκδήλωση της νόσου. Αποτέλεσμα όλης την προσπάθειας ήταν η ανίχνευση γενετικών τόπων οι οποίοι στοχεύουν σε καινούρια μονοπάτια όσον αφορά την ευπάθεια στη νόσο. Δεδομένης της ατελούς κατανόησης της γενετικής αιτιολογίας της διαβητικής νεφροπάθειας, στην παρούσα διδακτορική διατριβή τέθηκε ως στόχος η ταυτοποίηση των γενετικών παραλλαγών (πολυμορφισμών) γονιδίων που σχετίζονται με το νόσημα. Κατά τη μεθοδολογική προσέγγιση, εφαρμόστηκαν τεχνικές μοριακής ιατρικής βασισμένης σε ενδείξεις σε διαθέσιμα δεδομένα μελετών γενετικής σύνδεσης και μελέτων γενετικής συσχέτισης. Η πολυπαραγοντική αιτιολογία της διαβητικής νεφροπάθειας, όπως και των άλλων σύνθετων νοσημάτων εμπεριέχει πολύπλοκες επιστατικές αλληλεπιδράσεις, καθώς και αλληλεπιδράσεις μεταξύ γονιδίων και περιβάλλοντος, μειώνοντας την πιθανότητα ένας μοναδικός τύπος έρευνας να παρέχει οριστικές απαντήσεις. Εναλλακτικά, μια προσέγγιση ενοποίησης και συνδυασμού διαφορετικών ειδών πληροφοριών γενετικών αναλύσεων (γενετική σύγκλιση) έχει προταθεί για την απόδοση πολλά υποσχόμενων αποτελεσμάτων από τον όγκο των πληροφοριών που συσσωρεύονται εκθετικά. Απόδειξη για την εμπλοκή ενός γενετικού τόπου μπορεί να θεωρηθεί ως πιο έγκυρη όταν υποστηρίζεται από ανεξάρτητες ερευνητικές μεθοδολογίες, όπως μελέτες γενετικής σύνδεσης και μελετών γενετικής συσχέτισης. Για τον προσδιορισμό των σημαντικών γενετικών τόπων σχετιζόμενων με τη διαβητική νεφροπάθεια πραγματοποιήθηκε μια μετα-ανάλυση σαρώσεων ευρείας γονιδιωματικής σύνδεσης για τη διαβητική νεφροπάθεια. Η μετα-ανάλυση πραγματοποιήθηκε με μεθοδολογία που αναπτύχθηκε στο Εργαστήριο Βιομαθηματικών. Προσδιορίστηκαν έξι χρωμοσωμικά τμήματα με στατιστική υποστήριξη σύνδεσης (7p22.3-7p15.3, 13q33.1-13q34, 16p12.3-16q12.2, 17q24.3-17q25.3, 21q22.11-21q22.3, 22q11.1-22q12.3) αναδείχτηκαν στατιστικά σημαντικά τόσο στην κύρια ανάλυση όσο και στις υπο-αναλύσεις αναλόγως του υποκείμενου διαβήτη ταυτόχρονα στις σταθμισμένες και μη αναλύσεις, εκ των οποίων μόνο το τμήμα 22q11.1-22q12.3 παρέμεινε στατιστικά σημαντικό και σε ευρυ-γονιδιωματικό επίπεδο σημαντικότητας. Δύο από τα προαναφερθέντα τμήματα (13q33.1-13q34, 17q24.3-17q25.3) περιγράφηκαν για πρώτη φορά. Οι τόποι αυτοί συνιστούν περιοχές προτεραιότητας σε μελλοντικές έρευνες, καθώς η γονοτύπωση των συγκεκριμένων περιοχών με επιπλέον γενετικούς δείκτες θα μπορούσε να συνδράμει στον προσδιορισμό των υπεύθυνων γονιδίων για τη γενετική προδιάθεση ανάπτυξης διαβητικής νεφροπάθειας.Στον τομέα των μελετών γενετικής συσχέτισης, πραγματοποιήθηκε μετα-ανάλυση των μελετών που αφορούν γονίδια που εμπλέκονται στους μηχανισμούς του ανοσοποιητικού συστήματος ώστε να διερευνηθεί η συμβολή του ανοσοποιητικού συστήματος και της φλεγμονής στην παθογένεση της νόσου. Συνολικά, μελετήθηκαν 75 υποψήφια γονίδια που ανήκουν σε 6 μονοπάτια σύμφωνα με την ταξινόμηση της Εγκυκλοπαίδειας του Κιότο των Γονιδίων και των Γονιδιωμάτων (KEGG) και 443 πολυμορφισμοί που μελετήθηκαν σε 103 μελέτες, ενώ 138 πολυμορφισμοί συμμετείχαν στην ποσοτική σύνθεση των αποτελεσμάτων. Το κύριο εύρημα της μετα-ανάλυσης συνίσταται στο ό,τι πολυμορφισμοί στα γονίδια CCL2, CCR5, IL6, IL8, EPO, IL1B, IL1O, IL1RN, GHRL, MMP9, TGFB1, VEGFA, MMP3, MMP12, IL12RB1, PRKCE, TNF, TNFRSF19 και IL1A σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης διαβητικής νεφροπάθειας.Παράλληλα, εκτός των προαναφερθέντων γονιδίων, πραγματοποιήθηκε μια σύνοψη πεδίου όλων των μελετών γενετικής συσχέτισης, τόσο υποψήφιων γονιδίων όσο και μελετών ευρείας γονιδιωματικής συσχέτισης, όσον αφορά τη διαβητική νεφροπάθεια. Οι κύριες μετα-αναλύσεις ανέδειξαν στατιστικά σημαντικό ρόλο για 57 πολυμορφισμούς, εκ των οποίων 29 από την ανάλυση γενοτύπων και 28 από την ανάλυση αλληλίων. Οι συγκεκριμένοι πολυμορφισμοί ανήκουν στα εξής 39 γονίδια: ACACB, ACE, ADIPOQ, AGT, AKR1B1, APOC1, APOE, ATP1B2, ATP2A3, CARS, CCR5, CNDP1, EDN1, ENPP1, EPO, FLT4, GLO1, HMGA2, IGF2/INS/TH cluster, KCNQ1, KNG, LOC101927627, LOC105370358, MMP3, MMP12, MTHFR, NOS3, SDC2, SETD7, SIRT1, SLC12A3, SLC2A1, SLC2A2, TCF7L2, TGFB1, TIMP1, UNC13B, VEGFA και XYLT1, ενώ δε θα πρέπει να θεωρηθούν ελάσσονος σημασίας 2 πολυμορφισμοί που δεν ανήκουν σε γονίδιο (rs1866813, rs4972593).Επιπρόσθετα, εφαρμόστηκε η μεθοδολογία της γονιδιωματικής σύγκλισης προς προσδιορισμό γενετικών τόπων με ταυτόχρονη στατιστική υποστήριξη από ανεξάρτητες μεθοδολογικές προσεγγίσεις.