Μελέτη εκφράσεως, τοπογραφικής κατανομής και συσχέτισης επιθηλιακής μεσεγχυματικής μετατροπής και πολυδύναμου αρχέγονου δυναμικού σε καρκινώματα αγνώστου πρωτοπαθούς εστίας

Abstract

CUP is a model disease for early dissemination of the primary tumour to distant sites. The metastaticspread occurs early during the disease course before the primary reaches a detectable size, producesa high tumour burden and is related to resistance to antineoplastic therapies. Consequently, weconsidered it biologically relevant and appropriate to investigate the incidence, correlations andprognostic utility in CUP of one of the pivotal phenomena implicated in metastatic dissemination, theEMT. EMT occurs during embryonic morphogenesis in multicellular organisms, in which embryonicmesenchymal cells are formed and become motile following the loss of epithelial cell polarity. In recentyears, EMT has also been recognised as a potential mechanism for cancer progression. Duringprogression to metastatic competence, carcinoma cells acquire altered adhesive properties, activateproteolysis and motility programmes, metastasize and establish deposits at distant sites.A central event in EMT is the down-regulation of E-cadherin that leads to the loss of cell–cell contactand the consecutive progression of cells towards a mesenchymal-like phenotype with up-regulation ofN-cadherin and vimentin. The transcription factor SNAIL is a major suppressor of E-cadherin and astrong inducer of EMT. SNAIL has been shown to down-regulate E-cadherin in cell cultures,transfection and knock-out experiments in transgenic mice and in different types of human tumours,e.g, hepatocellular carcinomas, carcinoma from the esophagus, cardia and stomach, and colorectalcarcinomas. Expression of SNAIL in epithelial tumours increases their aggressiveness, as seen inexperimentally induced breast tumours. Moreover, high SNAIL expression correlated with an increasedrisk of tumour relapse and poor survival rates in human breast and gastric cancer. Recently, EMT hasbeen linked to the acquisition of a stem cell-like phenotype as seminal in vitro experiments showed thatepithelial cells induced to undergo EMT become spindle shaped, evade apoptosis and anoikis-relateddeath, express a battery of stemness markers and have the ability to create colonies andmammospheres that re-acquire the cellular heterogeneity of the initial tumour from which they wereharvested. Our retrospective analysis of 100 patients with CUP used IHC staining of TMAs, examining twocores for each patient for specific EMT biomarkers in order to minimize the impact of random samplingfrom tumour areas with unique characteristics. The combination of E-cadherin, N-cadherin, vimentinand SNAIL was selected in order to define a more complex but also more secure definition of the EMTphenotype, whereas OCT4 was selected in order to explore its relation to stem-like features.The EMT phenotype was defined as partial loss of E-cadherin expression with simultaneousexpression of N-cadherin/vimentin along with concomitant expression of SNAIL, as assessed by thepercentage of staining tumour cells. Since there is no validated scoring system for interpreting IHCstaining for the biomolecules under study, and given the fact that there is no previous experience withthese in CUP, IHC cut-off values were defined prospectively, based on distributional analyses infrequency histograms. In particular, IHC staining evaluation was based on the following cut-offs: partialloss of E-cadherin expression when staining was seen in <60% of tumour cells; positive cases for Ncadherinnd vimentin expression were those tumours in which staining was seen in >40% of tumourcells; positive by SNAIL expression was established when staining was seen in >80% of tumour cells;while positive cases for OCT4 were those with staining in at least 1% of tumour cells. For NOTCHprotein expression, IHC staining was considered to be positive based on the following cut-offs:NOTCH1 staining in ≥5% of tumour cells, NOTCH2 >20%, NOTCH3 >80%. In view of the lack of dataon the optimal way to assess IHC expression of EMT markers, we sought to explore a semiquantitativemethod of IHC biomolecule staining, previously used in other studies. In addition tocounting the percentage of staining cells, we also evaluated the staining intensity and derived the Hscore.We prospectively selected one cut-off value only for each biomarker based on distributional andROC analyses and taking into account the relevant literature rather than perform multiple, exploratoryanalyses using multiple cut-offs. Moreover, when possible we analysed correlations of biomolecules byexamining them as continuous variables rather than as categorical ones. An EMT phenotype was seenin 8 cases (8.1%) and was strongly associated with poor OS (median OS EMT - =13 months vs.median OS EMT+ = 8 months, p=0.023). When we used staining intensity (H-Score), an EMTphenotype was observed for 16 patients and carried borderline adverse prognostic utility for outcome(median OS 9 vs. 14 months, p=0.07). The presence of EMT phenotype correlated significantly with male gender, high grade and presence of visceral metastases (χ2 p<0.05), while EMT mediatorexpression was correlated to high NOTCH 2/3 expression. Other factors prognostic for poor survivalwere male gender, PS>2, non-platinum therapy (χ2 p<0.05). However, despite these robust differencesin survival according to EMT status, it is indisputable that the EMT phenotype is quite rare in our groupof patients, with an incidence of only 8% based on staining cell percentage and 16% based on the HScore.Amongst hypotheses that could interpret this finding, we could cite protein degradation in thetumour block by inadequate fixation, problematic antigen retrieval or even protein stainingunderestimation in old archival material derived from biopsied metastases. Another factor limiting theEMT rate may be that TMAs were obtained from the centre of the tumour in contrast to recent studiessuggesting that EMT processes take place at the periphery of the tumour, the invasive front. Finally,the complexity of the signalling networks that regulate the induction of EMT and the reversibility of theacquired mesenchymal phenotype also pose significant challenges.To take one step further, among the aforementioned 100 CUP Patients, in 68 CUP casesimmunohistochemically characterised as EMT-positive (n=5 by % of cells or n=10 by a semiquantitativeH-score) or EMT-negative, we studied the global expression profile of 982 microRNAs by means ofmicroarray technology.We aimed to screen for miRNA differentially expressed by EMT status in orderto study their role in the regulation of the EMT phenotype in cancer of unknown primary. MicroRNAs(miRNA) are an extensive class of 18-24 nucleotide-long, highly conserved non-coding RNA moleculesthat post-transcriptionally regulate key biological processes, including differentiation and development,cellular proliferation and metabolism. Therefore, miRNA expression has been associated with bothoncogenic and tumour suppressive activity and in addition, miRNAs were discovered to possessregulatory pro- and anti-metastatic effects. Recent studies have shown that the members of the miR-200 family (miR-200a,b,c miR-141 and miR-429) and miR-205 are essential regulators of the epithelialcharacter of cells, in a wide array of cell types and tissues including adipocytes, pancreatic cells,hepatocytes and olfactory neurons. The miR-200 family regulates the epithelial character of cellsthrough the targeted silencing of the zinc finger E box-binding homeobox (ZEB) family of transcriptional factors ZEB1 and ZEB2 which repress the transcription of genes containing E-box elements in theirpromoters, including E-cadherin. In addition to the miR-200 family, miR-205 has been shown to targetZEB1 and ZEB2 through their 3’ untranslated regions. Even though our results were not statisticallysignificant, we showed a tendency of the EMT-repressor miRNAs of the miR-200 family and miR-203 tobe downregulated in the EMT positive cases both when the EMT phenotype definition is based on the percentage of staining cells (2.45-3.64-fold lower expression level) and on the H-score (1.26-2.09-foldlower expression levels). Furthermore, the fact that the EMT-suppressor miRNAs were upregulated inthe N-cadherin-low tumours suggests that the observed trend was probably not due to chance. In ourdata, miR-205 showed a trend of upregulation in EMT positive cases, which was not statisticallysignificant. High miR-205 expression is seen in squamous tissues, the tissue specificity of miRNAsbeing a well-studied phenomenon. We believe that the increased expression of miR-205 in EMTpositivecases could be explained by the preponderance of squamous histology in this group, as it didnot persist when we excluded squamous CUP from the analysis by EMT status.To conclude, our work is the first to examine EMT in a model disease for metastaticdissemination such as CUP and established EMT as having an adverse prognostic significance forpatient outcome. Furthermore, a global miR expression profiling in EMT-positive vs EMT-negative CUPcases is innovative. Studies of larger and more homogeneous populations of patients with CUP arewarranted in order to accumulate more data on the molecular mechanisms underlying EMT, solvemethodological issues, confirm the importance of this process in cancer and examine the potentialregulatory role of the miR-200 family members in EMT, as well as their candidacy as therapeutictargets.

Εισαγωγή. Η Επιθηλιακή Μεσεγχυματική Μετατροπή (ΕΜΤ) αναφέρεται στις φαινοτυπικές αλλαγές πουυφίσταται ένα επιθηλιακό κύτταρο οι οποίες το καθιστούν χαλαρό από επιθηλιακές συνδέσεις, ευκίνητοκαι επιθετικό. Η. ΕΜΤ έχει συσχετισθεί με αυξημένο στάδιο, επιθετικότητα, μεταστατικότητα και πτωχήπρόγνωση σε ασθενείς με συμπαγείς όγκους. Στόχος της συγκεκριμένης μελέτης είναι να αναδείξουμετην ενεργοποίηση της ΕΜΤ σε ένα τύπο όγκων οι οποίοι είναι κατεξοχήν μεταστατικοί, στακαρκινώματα αγνώστου πρωτοπαθούς εστίας (ΚΑΠΕ), και να αποδείξουμε ότι η ύπαρξη του ΕΜΤφαινότυπου συσχετίζεται με αρνητική προγνωστική αξία για τον ασθενή. Επιπροσθέτως επιδιώξαμε νασυγκρίνουμε την έκφραση μιας «βιβλιοθήκης» απο 982 microRNAs (miR), σε ΕΜΤ + έναντι ΕΜΤ –όγκους ασθενών με ΚΑΠΕ ώστε να εξετάσουμε την συμβολή τους στον ΕΜΤ φαινότυπο.Μέθοδοι. Ιστικοί κύλινδροι 1.5mm από 100 ΚΑΠΕ φορτώθηκαν σε ιστικές μικροσυστοιχίες σε δύοαντίγραφα και μελετήθηκαν για ανοσοϊστοχημική έκφραση E-cadherin (ECADH- Zymed, dilution1:30), N-Cadherin (NCADH-Zymed, dilution 1:30), Vimentin (VMN-Zymed, dilution 1:30), Snail (SNLAbcam,dilution 1:10).Ο EMT φαινότυπος ορίστηκε ως απώλεια έκφρασης της Ε-cadherin, έκφρασηοποιασδήποτε από τις Ν-cadherin, Vimentin και ταυτόχρονη έκφραση SNAIL, όπως υπολογίστηκε απότο ποσοστό των χρωματισμένων κυττάρων. Πλήρη κλινικοπαθολογοανατομικά στοιχεία καταγράφηκανηλεκτρονικά για στατιστική ανάλυση. Στη συνέχεια, μελετήσαμε την έκφραση των 982 microRNAs σε 68ΚΑΠΕ από τα οποία ελήφθη επαρκής ποσότητα RNA χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα miRviewmets2, Rosetta Genomics και συγκρίναμε έκφραση σε ΕΜΤ+ (Ν=5 με βάση το % των χρωματισμένωνκυττάρων ή Ν=10 με βάση την ημιποσοτική μέθοδο του H-score) έναντι ΕΜΤ- περιπτώσεων.Αποτελέσματα. Ο υπό μελέτη πληθυσμός αποτελούνταν από 100 ασθενείς με ΚΑΠΕ (47 άνδρες, 53γυναίκες) διάμεσης ηλικίας 65 χρόνων και με καλή φυσική κατάσταση (PS 0-1 σε 75%). Η ιστολογικήδιάγνωση ήταν αδενοκαρκίνωμα στο 60% των ασθενών, πλακώδες καρκίνωμα στο 22% και μηδιαφοροποιημένο καρκίνωμα στο 17% με χαμηλό βαθμό διαφοροποιήσης στο 50% των περιπτώσεων.Οι κλινικοπαθολογοανατομικές υποομάδες ήταν 30% σπλαγχνικές μεταστάσεις, 8% λεμφαδενικέςμεταστάσεις μασχάλης, περιτοναϊκή καρκινωμάτωση 22% και λεμφαδενική νόσος 40%. Η θεραπεία αποτελούνταν από παρηγορητική χημειοθεραπεία (σχήματα με βάση την πλατίνα στο 55%). Η διάμεσηελεύθερη νόσου επιβίωση(PFS) καθώς και η ολική επιβίωση (OS) ήταν 7 και 12 μήνες αντίστοιχα.Μέσω μελέτης κατανομών συχνοτήτων και φυσικών ορίων έκφρασης των ανοσοϊστοχημικών δεικτών,ο ΕΜΤ φαινότυπος ορίστηκε ως απώλεια έκφρασης της E-cadherin (αρνητική, όταν εκφράζεται σε<60% των καρκινικών κυττάρων), έκφραση Ν-cadherin ή Vimentin (θετική, όταν εκφράζονται σε >40%των καρκινικών κυττάρων) και έκφραση Snail (θετική, όταν εκφράζεται σε >80% των καρκινικώνκυττάρων). Τον ορισμό αυτό πληρούσαν 8 ασθενείς (8%) και ο ΕΜΤ φαινότυπος αποδείχθηκεστατιστικά σημαντικός παράγοντας φτωχής επιβίωσης (ΕΜΤ- διάμεση επιβίωση 13 μήνες σε σχέση μεΕΜΤ+ διάμεση επιβίωση 8 μήνες, logrank p=0.023). Επιπλέον, η ύπαρξη ΕΜΤ φαινότυπου έδειξεστατιστικώς σημαντική συσχέτιση με το άρρεν φύλο, τη χαμηλή διαφοροποιήση του όγκου και τηνεμφάνιση σπλαχνικών μεταστάσεων (p<0.05). ‘Αλλοι προγνωστικοί παράγοντες φτωχής επιβίωσηςαναδείχθηκαν το άρρεν φύλο, η κακή φυσική κατάσταση κατά τη διάγνωση και η μη θεραπευτικήαντιμετώπιση με βάση την πλατίνα (p<0.05).Στο δεύτερο μέρος της μελέτης μας, ο υπό μελέτη πληθυσμός αποτελούνταν απο 68 ασθενείς μεΚΑΠΕ. Σε αυτούς τους ασθενείς, τα ΕMT-κατασταλτικά miRNAs miR-141, miR203 και miR200a,b,cπαρουσίασαν 2.45-3.64 φορες μειωμένη έκφραση σε ΕΜΤ+ περιπτώσεις, χωρίς ωστόσο να επιτευχθείστατιστική σημαντικότητα (False Discovery Rate, FDR>0.1). Η έκφραση του miR205 παρουσιάστηκεαυξημένη στις ΕΜΤ + περιπτώσεις αλλά αυτή η διαφορά οφείλoνταν στην παρουσία όγκων μεπλακώδη ιστολογία. Επιπλέον, συγκρίθηκε η έκφραση 982 microRNA στα περιστατικά ανάλογα με τηνανοσοϊστοχημική έκφραση κάθε μιας πρωτείνης εκ των E-cadherin, N-Cadherin, Vimentin, Snail. Ανκαι δεν βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές είναι αξιοσημείωτο ότι τα miR 203, 200c και 205 πουκαταστέλλουν την έκφραση του ΕΜΤ φαινότυπου είχαν αυξημένη έκφραση στους όγκους με χαμηλήέκφραση N-cadherin.Συμπεράσματα. Ο ΕΜΤ φαινότυπος δεν ανευρίσκεται συχνά σε έναν τόσο ετερογενή πληθυσμό όπωςτα ΚΑΠΕ, ωστόσο επηρεάζει-στατιστικώς σημαντικά-αρνητικά την επιβίωση των ασθενών πιθανόνμέσω πρόωρης συστηματικής διασποράς και αναπλασίας. Επιπλέον, η μελέτη έκφρασης 982 miRNAsσε ΕΜΤ+ vs EMT- ΚΑΠΕ δημιουργεί ενδείξεις οτι τα miR141, miR203, miR200a,b,c καταστελλουν τονΕΜΤ φαινότυπο και ειναι αυξημένα στις ΕΜΤ- περιπτώσεις. Αυτές οι ενδείξεις απαιτούν περαιτέρωεπιβεβαίωση σε ένα μεγαλυτερο αριθμό ασθενών με απώτερο σκοπό τη θεραπευτική τους στόχευση.