FT-IR φασματοσκοπική μελέτη ασθενειών των οστών

Abstract

The study of bone diseases and their treatment is directly related to the knowledge of the lesions that are induced at the molecular level of biological molecules, tissues and body fluids. To date there are no drugs that could repair the damage, and unfortunately the usual treatment of most diseases is surgical removal of the pathological bone segment. Knowing therefore the mechanism of disease could possibly lead to the development of the pharmaceutical treatment in cases where it could be applied.In this study we used non-destructive methods such as infrared spectroscopy with Fourier transform (Fourier Transform Infrared, FT-IR) and scanning electron microscope (Scanning Electron Microscopy, SEM) and XRD (X-Ray Diffraction).For the study were obtained cortical specimens, spongy and bone cartilage from 42 patients aged 31-87 years who underwent surgery. Of these 15 came from patients with developmental dysplasia of the hip, one with ankylosing arthritis of the hip, 4 of heterotopic ossification of the hip, 3 due to osteonecrosis of the femoral head, one from rheumatoid arthritis of the knee, 2 from total knee arthroplasty loosening, four from total hip arthroplasty loosening and two from psoriatic arthritis (hip and knee) and 10 cancerous. The samples were not undergone any preparation other than removal of fatty components of the bone and of the blood of the external surface of the bone.Infrared spectra showed significant differences between healthy bones and bones which were derived from patient samples, as well as between different diseases. The changes observed were a combination of the mechanism of the disease and the individual components of the pathologic bone. In general it was found that in each case the oxidative stress is involved in any stage of the disease development. Under oxidative stress are produced free radicals (ROS, reactive oxygen species), which lead to lipid and phospholipid peroxidation of cell membranes and thus their destruction or death.The reductions of intensities, the shifts of characteristic absorptions bands of vOH and vNH groups in the spectral region of 4000-3000 cm-1 show reduction of OH groups of hydroxyapatite and the hydrogen bonds that hold the alpha-helix of collagenous proteins alter their intensity, respectively. This is confirmed by the shift of the bands of the Amide I and Amide II proteins to shorter frequencies in the range 1700-1500 cm-1, as a result of destruction of the alpha-helix. This phenomenon is more pronounced in the case of cartilage. The band at about 3080 cm-1, which is attributed to stretching vibrations of terminal olefinic (v=CH2) bonds, confirms the effect of free radicals during the disease progression.The increasing intensity of the bands of methyl bands (vCH3) and methylene (vCH2) vibrations at the spectral region 3000-2850 cm-1 is found to be related to increasing of lipophilic environment, as a result of the effect of oxidative stress.The band at 1743 cm-1 that is attributable to aldehyde vC=O vibrations is associated with oxidative stress and therefore with inflammation. In patients who experienced chronic inflammation the intensity of this band is higher.Infrared spectra showed the destruction of bone and hydroxyapatite converting to calcium phosphate salts, inducing greater hardness and brittleness in the bone. The destruction of the biological hydroxyapatite is confirmed by XRD analysis.The SEM analysis of the surface architecture of bones showed the damaged proteins. Using Image J analysis it was possible to observe the cross-link and branch-link polymerization sites. These positions are the active sites of phosphate salts formation, which reduce bone strength. These observations confirm the effect of free radicals.The heterotopic ossification does not appear to be a result of osteoblasts’ activation, but due to ATP function failure in the normal cycle as a result to ischemic events prevailing in the bone growth area. This was confirmed by comparing the spectra of heterotopic bone and aortic valve calcification. This finding was confirmed by XRD analysis.Finally, we consider that the formation of amyloid proteins is the cause of resistance to chemotherapy and bone radiotherapy.

Οι παθήσεις των οστών και η θεραπεία τους σχετίζονται άμεσα με την γνώση των βλαβών που προκαλούν οι ασθένειες σε μοριακό επίπεδο των βιολογικών μορίων, ιστών και υγρών του σώματος. Μέχρι σήμερα, πολλές από τις ασθένειες δεν μπορούν να αντιμετωπιστούν μη επεμβατικά, επειδή δεν έχουν παρασκευασθεί φάρμακα τα οποία θα μπορούσαν να επιδιορθώσουν τις βλάβες. Δυστυχώς, μέχρι σήμερα, η συνήθης αντιμετώπιση των περισσότερων ασθενειών είναι η χειρουργική αφαίρεση του τμήματος του οστού που έχει φθαρεί. Η γνώση επομένως των βλαβών οι οποίες προκαλούνται από τις ασθένειες θα μπορούσε ενδεχομένως να οδηγήσει στην ανάπτυξη φαρμάκων και την εξέλιξη της μη επεμβατικής αντιμετώπισης αυτών των ασθενειών .Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν μη καταστρεπτικές μέθοδοι, όπως η υπέρυθρη φασματοσκοπία με μετασχηματισμό Fourier (Fourier Transform Infrared, FT-IR) και ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο σάρωσης (Scanning Electron Microscopy, SEM) και περίθλαση ακτίνων Χ (XRD, X-Ray Diffraction).Για την μελέτη λήφθηκαν δείγματα φλοιώδους και σπογγώδους οστού, καθώς και χόνδρου οστού από 42 ασθενείς ηλικίας 31 έως 87 ετών, οι οποίοι υποβλήθηκαν σε χειρουργική αντιμετώπιση. Από αυτά 15 προήλθαν από ασθενείς με αναπτυξιακή δυσπλασία του ισχίου, 1 από αγκυλοποιητική αρθρίτιδα του ισχίου, 4 από έκτοπη οστεοποίηση του ισχίου, 3 λόγω οστεονέκρωσης της μηριαίας κεφαλής, 1 από ρευματοειδή αρθρίτιδα του γόνατος, 2 έπειτα από χαλάρωση ολικής αρθροπλαστικής γόνατος, 4 έπειτα από χαλάρωση ολικής αρθροπλαστικής ισχίου και 2 από ψωριασική αρθρίτιδα (ισχίου και γόνατος) και 10 καρκινικά. Τα δείγματα δεν υπέστησαν καμία επεξεργασία πέραν της αφαίρεσης των προσμίξεων αίματος και λιπαρών συστατικών του εξωτερικού περιβάλλοντος του οστού. Τα υπέρυθρα φάσματα έδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των υγιών οστών και των οστών τα οποία προήλθαν από τα δείγματα των ασθενών. Οι μεταβολές ήταν συνάρτηση της ασθένειας αλλά και των συστατικών του εκάστοτε οστού. Γενικά διαπιστώθηκε ότι σε κάθε περίπτωση το οξειδωτικό στρες συμμετέχει σε κάποιο από τα στάδια της ανάπτυξης της ασθένειας. Κατά το οξειδωτικό στρες παράγονται ελεύθερες ρίζες (ROS, reactive oxygen species) οι οποίες οδηγούν σε υπεροξείδωση των λιπιδίων και φωσφολιπιδίων των μεμβρανών των κυττάρων και κατά συνέπεια στην καταστροφή των κυττάρων. Από τις μειώσεις των εντάσεων και τις μετατοπίσεις των απορροφήσεων τάσης των ομάδων νΟΗ και νΝΗ στην περιοχή του φάσματος από 4000-3000 cm-1 φαίνεται ότι ο υδροξυαπατίτης χάνει τις ομάδες -ΟΗ, ενώ οι δεσμοί υδρογόνου οι οποίοι συγκρατούν την α-έλικα των κολλαγονούχων πρωτεϊνών μεταβάλλουν την έντασή τους. Αυτό επιβεβαιώνεται από τις μετατοπίσεις των ταινιών των Amide I και Amide II των πρωτεϊνών προς μικρότερες συχνότητες στην περιοχή 1700-1500 cm-1, ως αποτέλεσμα της καταστροφής της α-έλικας. Το φαινόμενο αυτό είναι περισσότερο έντονο στην περίπτωση των χόνδρων. Η ταινία περίπου στα 3080 cm-1, η οποία συνδέεται με την ολεφινική ομάδα (v=CH) επιβεβαιώνει την επίδραση των ελευθέρων ριζών στα στάδια της ασθένειας. Η αύξηση των εντάσεων των ταινιών των μεθυλ (vCH3) και μεθυλενομάδων (vCH2) στην περιοχή 3000-2850 cm-1 συνδέεται με την αύξηση του λιπόφιλου περιβάλλοντος, ως αποτέλεσμα της επίδρασης του οξειδωτικού στρες και τον σχηματισμό αμυλοειδών πρωτεϊνών. Η ταινία στα 1743 cm-1 η οποία αποδίδεται σε σχηματισμό αλδεϋδικών ομάδων συνδέεται με το οξειδωτικό στρες και επομένως με την φλεγμονή. Σε ασθενείς οι οποίοι εμφάνιζαν χρόνια φλεγμονή η ένταση της ταινίας είναι αρκετά υψηλή. Τα υπέρυθρα φάσματα έδειξαν την καταστροφή του υδροξυαπατίτη των οστών και την μετατροπή του σε άλατα του φωσφορικού ασβεστίου, προσδίδοντας επομένως μεγαλύτερη σκληρότητα και ευθραυστότητα στο οστό. Η καταστροφή του βιολογικού υδροξυαπατίτη επιβεβαιώθηκε με XRD ανάλυση.Οι SEM αναλύσεις έδειξαν την καταστροφή των πρωτεϊνών του οστού. Από την ανάλυση της εικόνας φάνηκαν οι θέσεις διασταυρούμενων (cross-link) και διακλαδούμενων (branch-link) πολυμερισμών. Οι θέσεις αυτές αποτελούν δραστικά σημεία σχηματισμού φωσφορικών αλάτων, τα οποία μειώνουν την αντοχή των οστών. Επίσης επιβεβαιώνουν την επίδραση των ελευθέρων ριζών.Η έκτοπη οστεοποίηση φαίνεται να μην είναι αποτέλεσμα της δράσης των οστεοβλαστών, αλλά της αδυναμίας λειτουργίας του ATP στον φυσιολογικό κύκλο λόγω ισχαιμικών επεισοδίων που επικρατούν στην περιοχή ανάπτυξης του οστού. Αυτό επιβεβαιώθηκε από την σύγκριση των φασμάτων έκτοπου οστού και επασβεστωμένης αορτικής βαλβίδας. Τέλος, στον σχηματισμό των αμυλοειδών πρωτεϊνών αποδίδουμε την αντίσταση στην θεραπευτική αγωγή και ακτινοθεραπεία των οστών.