Εφαρμογές στοχαστικών υβριδικών μοντέλων σε βιολογικά συστήματα

Abstract

Biological systems are inherently complex systems, consisting of a large number of biological entities that interact and cooperate in an orchestrated fashion in order to produce robust and adaptive behaviors. At the same time, biological systems are characterized by a high degree of randomness and uncertainty, as these interactions occur in a probabilistic manner. System-level analysis of biological processes requires advanced experimental methods and sophisticated computational models, so as to fully describe the nature of biological phenomena. In this context, stochastic hybrid systems, that can efficiently describe complex processes that include continuous evolution and switch-like activation of their parts in a probabilistic manner, have already found important applications in systems biology modeling and set the basis for further investigation. This thesis concerns the applications of stochastic hybrid systems in the modeling of biological processes. Focus is given in two major applications: analysis of protein kinetics using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) experiments and analysis of DNA re-replication.In the first part of the thesis, a complete workflow for the analysis of FRAP experimental data is proposed. We initially emphasized on the first steps of the analysis and developed the software easyFRAP, that enables the extraction of quantitative parameters from experimental FRAP recovery curves. We then present a stochastic hybrid model of FRAP experiments, based on a stochastic description of protein diffusion and binding at a particle level within a defined geometry representing the cell nucleus. Last, to infer kinetic parameters from FRAP experimental data, a novel parameter identification method was designed and implemented. The key idea behind the proposed method is the a priori construction of a mapping from the space of parameters associated with the recovery curves to the space of parameters of the underlying molecule kinetics. In this way, the method circumvents the repeated simulation of the model in the search of new estimates and provides interpolation within the range of parameters of the simulated curves. After validating the method in silico, parameter inference using experimental data on the proteins Cdt1-GFP, PCNA-GFP and GFPnls confirmed existing knowledge on the kinetic behavior of the proteins and provided additional insight on the cell-to-cell variability and identifiability of kinetic parameters.In the second part of the thesis, stochastic hybrid modeling is applied to the case of DNA re-replication, developed by refining existing work on normal DNA replication. The model accurately portrays the interplay between discrete dynamics, associated with different origin states, continuous dynamics, associated with the movement of the replication forks, and stochasticity, associated with random firing and re-firing events. Using input data from experimentally determined origin locations and efficiencies for the case of the fission yeast genome, the model allows the simulation of re-replication along the complete genome and thus the exploration of re-replication kinetics genome-wide. Comparison of in silico data for different model variations and sensitivity analysis on the model inputs has permitted insight into the parameters affecting re-replication dynamics. By comparing the simulated vs. the experimental amplification profiles at a population level, we observe that overall the simulated data reproduce the experimental re-replication pattern on a whole-genome scale, validating our approach. Striking differences regard specific regions, possibly attributed to location-specific cellular mechanisms. Analysis of simulated data at a single-cell level permits a more detailed insight into DNA re-replication. Amplification levels of individual loci were found to be affected by intrinsic properties in terms of firing efficiency, in cis effects from adjacent loci and in trans effects from distant loci. Overall, our analysis showed that, although re-replication profiles at the population level are robust, at the single-cell level they are characterized by a high degree of heterogeneity and can deviate significantly from the mean, since re-replication can, with varying probability, occur anywhere in the genome and generate many diverse genotypes within a population. Based on these observations we conclude that cell-to-cell variability is inherent in re-replication and can lead to a high degree of genome plasticity.

Τα βιολογικά συστήματα είναι εγγενώς πολύπλοκα συστήματα, που αποτελούνται από ένα μεγάλο αριθμό βιολογικών οντοτήτων που αλληλεπιδρούν και συνεργάζονται με συντονισμένο τρόπο έτσι ώστε να οδηγήσουν σε σταθερές και προσαρμοστικές συμπεριφορές. Ταυτόχρονα, τα βιολογικά συστήματα χαρακτηρίζονται από μεγάλο βαθμό τυχαιότητας και αβεβαιότητας, καθώς αυτές οι αλληλεπιδράσεις συμβαίνουν με πιθανοτικό τρόπο. Η συστημική ανάλυση των βιολογικών διεργασιών απαιτεί εξελιγμένες πειραματικές μεθόδους και προηγμένα υπολογιστικά μοντέλα έτσι ώστε να περιγράψει πλήρως τη φύση των βιολογικών φαινομένων. Σε αυτό το πλαίσιο, τα στοχαστικά υβριδικά συστήματα, ικανά να περιγράψουν αποδοτικά πολύπλοκες διεργασίες που εμπεριέχουν συνεχή εξέλιξη και διακριτή ενεργοποίηση των τμημάτων τους με πιθανοτικό τρόπο, έχουν ήδη βρει σημαντικές εφαρμογές στη μοντελοποίηση βιολογικών συστημάτων και έχουν θέσει τη βάση για περαιτέρω διερεύνηση. Η παρούσα διατριβή αφορά στις εφαρμογές των στοχαστικών υβριδικών συστημάτων στη μοντελοποίηση βιολογικών διεργασιών, με έμφαση σε δύο βασικές εφαρμογές: την ανάλυση της κινητικής των πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας πειράματα επαναφοράς φθορισμού μετά απο φωτολεύκανση (Fluorescence Recovery After Photoblaching - FRAP) και την ανάλυση της επαναντιγραφής του DNA. Στο πρώτο μέρος της διατριβής προτείνεται μια πλήρης ροή εργασίας για την ανάλυση των πειραμάτων FRAP. Αρχικά δόθηκε έμφαση στα πρώτα βήματα της ανάλυσης και για το σκοπό αυτό αναπτύχθηκε το λογισμικό easyFRAP, που επιτρέπει την εξαγωγή ποσοτικών παραμέτρων από πειραματικές καμπύλες FRAP. Στη συνέχεια παρουσιάζεται ένα στοχαστικό υβριδικό μοντέλο πειραμάτων FRAP, βασισμένο στη στοχαστική περιγραφή της διάχυσης και της πρόσδεσης των πρωτεϊνών σε επίπεδο μορίου μέσα σε μια καθορισμένη τρισδιάστατη περιοχή που αναπαριστά τον πυρήνα του κυττάρου. Τέλος, παρουσιάζεται μια νέα μέθοδος εξαγωγής των παραμέτρων της κινητικής από πειραματικά δεδομένα FRAP. Η βασική ιδέα πίσω από την προτεινόμενη μέθοδο είναι η εκ των προτέρων κατασκευή μιας χαρτογράφησης από το χώρο των παραμέτρων που σχετίζονται με τις καμπύλες επανάκτησης φθορισμού στο χώρο των παραμέτρων της κινητικής. Με αυτόν τον τρόπο η μέθοδος παρακάμπτει την επαναλαμβανόμενη προσομοίωση του μοντέλου κατά την αναζήτηση νέων προβλέψεων. Μετά την επικύρωση της μεθόδου χρησιμοποιώντας δεδομένα από προσομοίωση, η εξαγωγή παραμέτρων χρησιμοποιώντας πειραματικά δεδομένα από τις πρωτεΐνες Cdt1, PCNA και GFPnls επιβεβαίωσε την υπάρχουσα γνώση για την κινητική συμπεριφορά τους και παρείχε επιπρόσθετες πληροφορίες σχετικά με την ετερογένεια της κινητικής από κύτταρο σε κύτταρο και τη δυνατότητα πρόβλεψης και ακρίβεια των κινητικών παραμέτρων τους.Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, τα στοχαστικά υβριδικά μοντέλα χρησιμοποιούνται για τη μελέτη της επαναντιγραφής του DNA, επεκτείνοντας υπάρχουσα δουλειά για την περίπτωση της φυσιολογικής αντιγραφής. Το μοντέλο που αναπτύχθηκε αποτυπώνει με ακρίβεια την αλληλεπίδραση ανάμεσα στη διακριτή δυναμική, που σχετίζεται με διαφορετικές καταστάσεις των αφετηριών αντιγραφής, τη συνεχή δυναμική, που σχετίζεται με την κίνηση των διχάλων αντιγραφής, και την αβεβαιότητα, που σχετίζεται με τα τυχαία γεγονότα πυροδότησης και επαναπυροδότησης των αφετηριών. Χρησιμοποιώντας ως είσοδο πειραματικά δεδομένα από τον οργανισμό S.pombe, που περιέχουν θέσεις αφετηριών πάνω στο γονιδίωμα και τις αντίστοιχες αποδοτικότητές τους, το μοντέλο επιτρέπει την προσομοίωση της επαναντιγραφής και συνεπώς τη διερεύνηση της κινητικής της επαναντιγραφής κατά μήκος ολόκληρου το γονιδιώματος. Συγκρίνοντας δεδομένα από προσομοιώσεις για διαφορετικές υλοποιήσεις του μοντέλου και αναλύοντας την ευαισθησία του μοντέλου σε διαφορετικές τιμές των μεταβλητών εισόδου, εξάγουμε συμπεράσματα σχετικά με τις παραμέτρους που επηρεάζουν περισσότερο τη δυναμική της επαναντιγραφής. Συγκρίνοντας τα προφίλ επαναντιγραφής σε επίπεδο πληθυσμού με αντίστοιχα πειραματικά δεδομένα, παρατηρούμε ότι συνολικά οι προβλέψεις του μοντέλου αναπαράγουν τις πειραματικές παρατηρήσεις σε μεγάλο βαθμό κατά το μήκος ολόκληρου του γονιδιώματος, γεγονός που επιβεβαιώνει την προσέγγισή μας. Κάποιες σημαντικές αποκλίσεις παρατηρούνται σε μεμονωμένες περιοχές και πιθανώς οφείλονται σε ειδικούς τοπικούς κυτταρικούς μηχανισμούς. Η ανάλυση των δεδομένων σε επίπεδο κυττάρου επιτρέπει μια πιο λεπτομερή ματιά στη διαδικασία της επαναντιγραφής. Τα επίπεδα επαναντιγραφής μεμονωμένων περιοχών πάνω στο γονιδίωμα βρέθηκαν να επηρεάζονται από τις εγγενείς τους ιδιότητες, όπως η αποδοτικότητα της πυροδότησης, από in cis αλληλεπιδράσεις με γειτονικές περιοχές και από in trans αλληλεπιδράσεις με απομακρυσμένες περιοχές. Συνολικά η ανάλυσή μας έδειξε ότι, παρά το γεγονός ότι τα προφίλ επαναντιγραφής σε επίπεδο πληθυσμού είναι σταθερά, σε επίπεδο κυττάρου χαρακτηρίζονται από μεγάλο βαθμό ετερογένειας και αποκλίνουν σημαντικά από το μέσο όρο. Η επαναντιγραφή μπορεί, με διαφορετική πιθανότητα, να συμβεί οπουδήποτε πάνω στο γονιδίωμα και να οδηγήσει σε πολλούς διαφορετικούς γονότυπους σε έναν πληθυσμό. Βασισμένοι σε αυτές τις παρατηρήσεις, συμπεραίνουμε πως η ετερογένεια σε επίπεδο κυττάρου είναι εγγενές χαρακτηριστικό της επαναντιγραφής και οδηγεί σε μεγάλο βαθμό πλαστικότητας του γονιδιώματος.