Μελέτη RANKL-επαγόμενων παθογενετικών μηχανισμών σε γενετικά ζωικά πρότυπα και νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις

Abstract

Bone remodeling is a continuous process of renewal of the bone by sequentialactivation and function of osteoclasts and osteoblasts, cells responsible for boneresorption and production, respectively. Normally, both processes are in dynamicequilibrium with each other, ensuring the skeletal integrity. Disruption of this balanceis the primary cause of skeletal diseases, such as osteoporosis. The cytokine RANKL(Receptor Activator of Nuclear Factor kB Ligand), a TNF superfamily member(Tumor Necrosis Factor), is the main mediator in the process of bone resorption as itinduces differentiation, survival and activity of osteoclasts. As trimer RANKL bindsto its receptor, RANK, induces trimerization and activation of intracellular pathwaysleading to the generation of mature and functional osteoclasts, while the action ofRANKL is inhibited by osteoprotegerin (OPG), a soluble decoy receptor. The ratiobetween RANKL and OPG determines the availability and activity of RANKL inbiological systems. The significance of RANKL in bone biology derives from theevidences that mutations in the RANKL gene lead to autosomal recessiveosteopetrosis due to lack of osteoclasts. Conversely, increased production of RANKLis linked to excess osteoclast activity and bone loss diseases, such as osteoporosis,rheumatoid arthritis, multiple myeloma, bone metastases and periodontal diseases. The inhibition of RANKL is considered a promising therapeutic approach for theprevention of bone loss diseases and it has already been approved, through theadministration of a monoclonal antibody against RANKL (denosumab), inpostmenopausal osteoporosis, and in men with bone metastases derived from theprostate. This makes it necessary to find new inhibitors of RANKL and evaluate themin appropriate animal models.Within the present PhD Thesis we studied two new animal models which have beencreated by the research team of the Assistant Professor Eleni Douni. The first geneticmodel is characterized by autosomal recessive osteopetrosis due to a point mutation inthe mouse RANKL gene that causes an amino acid substitution from glycine toarginine at position 278, (G278R) making the RANKL protein inactive (Douni et al.2012). The study of the responsible mutation has led to the understanding of themolecular pathogenesis and design of new inhibitors against RANKL. In particularwe showed by immunoblot experiments and cross-linking of RANKLG278R that themutant protein does not form homotrimers and has lost its biological activity. Inaddition, the RANKLG278R does not induce osteoclast formation and exerts a dominant negative effect on the activity of wild type mouse RANKL. The amino acid glycine atposition 278 shows high conservation among the members of the TNF superfamily.Βy introducing the corresponding amino acid change, from glycine to arginine, inhuman TNF and BAFF proteins, we have shown that the mutant TNFG122R andBAFFG249R proteins do not form trimers and are biologically inactive. The recognitionof such an amino acid that is actively involved in the trimerization of the TNFsuperfamily members constitutes a potentially drug target for the rational design ofnew drugs that disrupt trimerization. The SPD-304 has been identified as smallmolecule inhibitor of TNF trimerization but its activity against RANKL wasunknown. We showed that SPD-304 interacts with RANKL inducingosteoclastogenesis inhibition. However, the high toxicity of SPD-304 makes itunsuitable for pharmaceutical use. So, we designed and synthesized 72 newcompounds depending on SPD-304 structure, 7 of which have been identified with thefollowing characteristics: 1) inhibit RANKL-induced osteoclastogenesis, 2) exhibitconsiderably less cytotoxicity compared with the SPD-304, and 3) display highspecificity to the target protein RANKL. Biochemical assays showed that such inhibitors disrupt the trimer formation of RANKL. The evaluation of these potentsmall molecule inhibitors of RANKL in preclinical level presupposes the use ofappropriate animal models of osteoporosis.In this context, we developed and characterized novel genetic models of osteoporosisby overexpression of human RANKL in transgenic mice. We characterized twotransgenic lines, the Tg5516 transgenic line that carries one copy of the transgene andthe Tg5519 line with ten extra copies. Quantitative analysis of huRANKL geneshowed expression in the Tg5516 mice with even higher levels in the Tg5519 micemainly in bone, spleen and brain. Moreover, the overexpression of the huRANKL inboth transgenic lines follows the same pattern of expression of the endogenous gene(muRANKL). Phenotypic characterization showed that the Tg5516 line represents amild model of osteoporosis with bone loss of trabecular bone, while the Tg5519 linedevelops severe osteoporosis characterized by complete loss of trabecular bone,cortical porosity, increased osteoclastogenesis, progressive destruction of the growthplate and increased bone marrow adiposity. Finally, upon the effective therapy ofosteoporosis in Tg5519 mice with denosumab, we concluded that the TgRANKL mice are appropriate models of osteoporosis for the preclinical evaluation of newdrugs, such as the SPD-304 analogues.

Η οστική ανακατασκευή είναι μια συνεχής διαδικασία ανανέωσης των μικρομονάδωντων οστών με διαδοχική ενεργοποίηση και λειτουργία των οστεοκλαστών καιοστεοβλαστών, κυττάρων υπεύθυνων για την οστική απορρόφηση και παραγωγή,αντίστοιχα. Φυσιολογικά και οι δύο διεργασίες βρίσκονται σε δυναμική ισορροπίαμεταξύ τους, εξασφαλίζοντας την σκελετική ακεραιότητα. Η διατάραξη αυτής τηςισορροπίας αποτελεί την κύρια αιτία πρόκλησης σκελετικών νοσημάτων, όπως ηοστεοπόρωση. Η κυτταροκίνη RANKL (Receptor Activator of Nuclear Factor κΒLigand) μέλος της υπεροικογένειας του TNF (Tumor Necrosis Factor), αποτελεί τονκύριο διαμεσολαβητή στην διαδικασία της οστικής απορρόφησης καθώς επάγει τηνδιαφοροποίηση, επιβίωση και ενεργοποίηση των οστεοκλαστών. Ως τριμερέςσυνδέεται στον υποδοχέα του RANK, επάγοντας τον τριμερισμό του και τηνενεργοποίηση των ενδοκυτταρικών μονοπατιών που οδηγούν στην δημιουργίαώριμων και λειτουργικών οστεοκλαστών, ενώ η δράση του RANKL αναστέλλεταιαπό την οστεοπροτεγερίνη (OPG), ένα ανταγωνιστικό διαλυτό υποδοχέα. Η αναλογίαμεταξύ RANKL και OPG καθορίζει τη βιοδιαθεσιμότητα και τη δράση του RANKLστα βιολογικά συστήματα. Η σημασία του RANKL στην βιολογία του σκελετικούσυστήματος φαίνεται από το γεγονός ότι μεταλλάξεις στο γονίδιο του RANKL προκαλούν αυτοσωμική υπολειπόμενη οστεοπέτρωση λόγω αδυναμίας σχηματισμούοστεοκλαστών. Αντιθέτως, αυξημένη παραγωγή του RANKL συνδέεται με επαγωγήοστεοκλαστικής δραστηριότητας και οστικής απώλειας σε ασθένειες όπως ηοστεοπόρωση, η ρευματοειδής αρθρίτιδα, το πολλαπλό μυέλωμα, οι οστικέςμεταστάσεις και οι περιοδοντικές ασθένειες. Η αναστολή της δράσης του RANKLθεωρείται μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση για την παρεμπόδιση τηςοστικής απώλειας στις παραπάνω ασθένειες και έχει ήδη εγκριθεί η χορήγηση ενόςμονοκλωνικού αντισώματος, του denosumab, έναντι του RANKL σεεμμηνοπαυσιακές οστεοπορωτικές γυναίκες. Το γεγονός αυτό καθιστά αναγκαία τηνεύρεση νέων αναστολέων του RANKL και την αξιολόγησή τους σε κατάλληλα ζωικάμοντέλα.Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκαν δύο μοναδικά ζωικάμοντέλα που έχουν δημιουργηθεί από την ερευνητική ομάδα της Επίκ. ΚαθηγήτριαςΕλένης Ντούνη. Το πρώτο γενετικό μοντέλο χαρακτηρίζεται από αυτοσωμικήυπολειπόμενη οστεοπέτρωση και οφείλεται σε μια σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιοRANKL του ποντικού που προκαλεί αντικατάσταση ενός αμινοξέος από γλυκίνη σε αργινίνη στην θέση 278, (G278R), καθιστώντας ανενεργή την πρωτεΐνη RANKL. Η μελέτη της υπεύθυνης μετάλλαξης έχει οδηγήσει στην κατανόηση του μοριακούπαθογενετικού μηχανισμού και στον σχεδιασμό νέων αναστολέων έναντι τουRANKL. Πιο συγκεκριμένα δείξαμε με πειράματα ανοσοαποτύπωσης και crosslinkingότι η μεταλλαγμένη RANKLG278R πρωτεΐνη δεν σχηματίζει ομοτριμερή καιέχει απολέσει την βιολογική της δραστικότητα. Ακόμη σε ex vivo κυτταρικές δοκιμέςδείξαμε ότι η RANKLG278R δεν επάγει τον σχηματισμό οστεοκλαστών ενώ ασκείκυρίαρχη αρνητική επίδραση στην δράση της άγριου τύπου RANKL. Λ όγω τ ηςυψηλής συντηρητικότητας που εμφανίζει η γλυκίνη στην θέση 278 μεταξύ των μελώντης υπεροικογένειας του TNF, προχωρήσαμε σε βιοχημικό και λειτουργικόχαρακτηρισμό των πρωτεϊνών TNF και BAFF του ανθρώπου εισάγοντας τηναντίστοιχη αμινοξική αλλαγή από γλυκίνη σε αργινίνη. Ομοίως, δείξαμε ότι οιμεταλλαγμένες TNFG122R και BAFFG249R πρωτεΐνες δεν σχηματίζουν τριμερή και δενείναι βιολογικά ενεργές. Η αναγνώριση ενός τόσο κρίσιμου αμινοξέος πουσυμμετέχει ενεργά στον τριμερισμό των πρωτεϊνών της TNF υπεροικογένειαςαποτελεί δυνητικά ένα σημαντικό φαρμακευτικό στόχο στην λογική σχεδιασμού νέωνφαρμάκων για την αναστολή του τριμερισμού. Το μικρό μόριο SPD-304 έχει χαρακτηριστεί ως ένας αναστολέας του τριμερισμού του TNF ωστόσο ηδραστικότητά του έναντι του RANKL δεν ήταν γνωστή. Δείξαμε ότι το SPD-304αλληλεπιδρά με την RANKL πρωτεΐνη προκαλώντας αναστολή σε δοκιμέςοστεοκλαστογένεσης. Όμως η υψηλή τοξικότητα του SPD-304 το καθιστάακατάλληλο για φαρμακευτική χρήση. Έτσι, σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν συνολικά72 ενώσεις ανάλογα του SPD-304 από τις οποίες ταυτοποιήσαμε 7 ενώσεις με τα εξήςχαρακτηριστικά: 1) αποτελούν ισχυροί αναστολείς σε δοκιμές οστεοκλαστογένεσης,2) παρουσιάζουν σημαντικά μικρότερη κυτταροτοξικότητα σε σχέση με το SPD304,και 3) παρουσιάζουν μεγάλη εξειδίκευση με την πρωτεΐνη-στόχο RANKL. Επίσης,βιοχημικός έλεγχος έδειξε ότι τα SPD-304 ανάλογα αποδιατάσσουν το τριμερές τουRANKL. Επόμενος στόχος είναι η αξιολόγηση αυτών των αναστολέων του RANKLσε προκλινικό επίπεδο με τη χρήση κατάλληλων ζωικών μοντέλων οστεοπόρωσης.Πάνω σε αυτή την λογική, προχωρήσαμε στην δημιουργία και χαρακτηρισμό ενόςκαινοτόμου γενετικού μοντέλου οστεοπόρωσης με την υπερέκφραση του RANKLτου ανθρώπου σε διαγονιδιακά ποντίκια. Χαρακτηρίσαμε 2 διαγονιδιακές σειρές, την Tg5516 που φέρει ένα αντίγραφο του διαγονίδιου και την Tg5519 με δέκα επιπλέοναντίγραφα. Ποσοτική ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του διαγονιδίου huRANKLέδειξε έκφραση στην Tg5516 σειρά και ακόμη υψηλότερα επίπεδα στην Tg5519σειρά κυρίως σε οστά, σπλήνα και εγκέφαλο. Επίσης, η υπερέκφραση του huRANKL στις δύο διαγονιδιακές σειρές ακολουθεί το ίδιο πρότυπο έκφρασης με το ενδογενέςγονίδιο (muRANKL). Ο φαινοτυπικός χαρακτηρισμός έδειξε ότι η Tg5516 σειράαποτελεί ένα μοντέλο ήπιας οστεοπόρωσης με οστική απώλεια του σπογγώδουςοστού, ενώ η Tg5519 σειρά εμφανίζει έντονη οστεοπόρωση με κύρια χαρακτηριστικάτην πλήρη απώλεια του σπογγώδους οστού, πορώδη δομή στο φλοιώδες οστό,αυξημένη οστεοκλαστογένεση, σταδιακή καταστροφή της αυξητικής πλάκας καιαυξημένη λιπογένεση στο μυελό των οστών. Τέλος, με την θεραπεία τηςοστεοπόρωσης στα Tg5519 ποντίκια έπειτα από χορήγηση του αντισώματοςdenosumab, διαπιστώσαμε ότι τα TgRANKL ποντίκια αποτελούν κατάλληλα μοντέλαοστεοπόρωσης για την αξιολόγηση νέων φαρμάκων, όπως των SPD-304 αναλόγων,σε προκλινικό επίπεδο.