Molecular, genetic and functional characterization of pesticide resistance mechanisms of Tetranychus urticae

Abstract

Tetranychus urticae is one of the most destructive agricultural pests. Its control is based mainly on the use of insecticides / acaricides. Due to the extensive use of chemical compounds and the life history traits they develop resistance quickly, showing striking phenotypes. Among them, several studies report resistance to abamectin, METIs and pyrethroids. Both target site resistance and metabolic resistance have been associated with these compounds. A functional link between cytochrome P450 metabolism and multi-insecticide resistance was investigated by expressing several P450s in an E. coli model system. CYP392A16 is capable to metabolize abamectin to a less toxic compound as confirmed by bioassays with the purified metabolite. An antibody was developed against CYP392A16, and successfully tested on resistant and susceptible spider mite homogenates showing high specificity and sensitivity in detecting the elevated levels of the CYP392A16 protein. Also, CYP392A11, a cytochrome P450 strongly associated with METI resistance, is capable to metabolise two METI acaricides, fenpyroximate and cyenopyrafen. It was shown that fenpyroximate metabolism produces a non toxic compound, while cyenopyrafen was metabolized to a hydroxylated compound. The GAL4/UAS system was used for ectopic co-expression of T. urticae cytochrome P450s and CPR in Drosophila, in order to validate their role in resistance to abamectin and METIs, in vivo. The transgenic lines co-expressing CYP392A16; TuCPR were successfully generated, and toxicity bioassays showed that they were resistant to abamectin in comparison to the control line. Also, TuCPR; CYP392A11 x GAL4 line was tested against fenpyroximate showing 2.6 folds resistance to the specific acaricide compared to the control line.The relative contribution of known avermectin (G314D, G326E) and pyrethroid (L1024V and F1538I) target-site mutations was examined in the resistance phenotype of T. urticae by undertaking a genetic approach. The mutations were introduced in a susceptible T. urticae genetic background through multiple genetic crosses and the lines homozygous for the mutations were examine by toxicity assays. It was shown that 314D and 326E alone have minor effect to abamectin and milbemectin resistance. However, their combination provides higher levels of resistance to these compounds, without reaching the resistance levels of the parental resistant strain. The results indicate involvement of additional mechanisms in the resistant phenotype. Also, the relative contribution of 1024V and 1538I in pyrethroid resistance was examined, by conducting toxicity assays with bifenthrin, fluvalinate and fenpropathrin. The results indicate that homozygous lines for either mutation show high resistance levels to these compounds.

Ο τετράνυχος, Tetranychus urticae Koch, αποτελεί σημαντικό εχθρό των καλλιεργειών. Καταπολεμάται κυρίως με εντομοκτόνα που σε συνδυασμό με τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του οργανισμού, εμφανίζει υψηλά επίπεδα ανθεκτικότητας σε μεγάλο αριθμό ουσιών, όπως αβερμεκτίνες, METIs και πυρεθροειδή. Η ανθεκτικότητα του τετρανύχου στα εντομοκτόνα είναι πιθανότατα αποτέλεσμα της μεταβολικής ανθεκτικότητας ή/ και αλλαγών στο στόχο του εντομοκτόνου.Ανάλυση δεδομένων γονιδιακής έκφρασης από ανθεκτικούς πληθυσμούς στις ουσίες αυτές δείχνουν υψηλά επίπεδα έκφρασης γονιδίων αποτοξικοποίησης και κυρίως P450s. Οι P450s CYP392A16 και CYP392A11 εκφράστηκαν επιτυχώς σε βακτηριακό σύστημα. Φάνηκε πως η CYP392A16 μεταβολίζει το εντομοκτόνο abamectin παράγοντας έναν μη τοξικό υδροξυλιωμένο μεταβολίτη, όπως επιβεβαιώθηκε και από πειράματα βιοδοκιμών. Επίσης, αναπτύχθηκε αντίσωμα για το συγκεκριμένο ένζυμο με υψηλή εκξειδίκευση για την CYP392A16 σύμφωνα με πειράματα ανοσοαποτύπωσης. Επιπρόσθετα, βρέθηκε πως η CYP392A11 μεταβολίζει δύο δραστικές ουσίες που ανήκουν στα METI ακαρεοκτόνα, τα fenpyroximate και cyenopyrafen. Ο μεταβολισμός του fenpyroximate οδηγεί στη δημιουργία ενός μη τοξικού μεταβολίτη και ο μεταβολίτης του cyenopyrafen είναι ένα υδροξυλιωμένο προϊόν.Με τη χρήση του GAL4/UAS συστήματος δημιουργήθηκαν διαγονιδιακά στελέχη δροσόφιλας στα οποία συνεκφράζονται οι CYP392A16 ή CYP392A11 με τη CPR του τετρανύχου και αξιολογήθηκε η δράση αυτών σε σχέση με τον φαινότυπο της ανθεκτικότητας. Το στέλεχος που εκφράζει την CYP392A16 και TuCPR εμφανίζει ανθεκτικότητα στο εντομοκτόνο abamectin σε σύγκριση με το στέλεχος αναφοράς. Επίσης, δημιουργήθηκε το στέλεχος TuCPR; CYP392A11 που εμφανίζει ανθεκτικότητα στο fenpyroximate. Μελετήθηκε η σχετική επίδραση γνωστών μεταλλαγών (G314D, G326E στα κανάλια χλωρίου και οι L1024V, F1538I στο κανάλι νατρίου) στον φαινότυπο της ανθεκτικότητας του τετρανύχου και η κάθε μεταλλαγή εισήχθησε σε ευαίσθητο γενετικό υπόβαθρο μέσω πολλαπλών διασταυρώσεων. Φάνηκε πως οι μεμονωμένες μεταλλαγές 314D και 326E προσδίδουν χαμηλά επίπεδα ανθεκτικότητας στις μακροκυκλικές λακτόνες. Ωστόσο, ο συνδυασμός τους προσδίδει υψηλότερη ανθεκτικότητα, αλλά χαμηλότερη σε σχέση με αυτή του ανθεκτικού πληθυσμού. Συνεπώς οι μεταλλαγές αυτές δεν αποτελούν τον μοναδικό μηχανισμό που συνεισφέρει ανθεκτικότητα στις ουσίες αυτές. Η ανθεκτικότητα στα πυρεθροειδή μελετήθηκε σε ομόζυγα στελέχη που φέρουν τις μεταλλαγές 1024V και 1538I. Τα στελέχη αυτά εμφανίζουν υψηλά επίπεδα ανθεκτικότητας στο bifenthrin, χαμηλότερα από αυτά των πατρικών στελεχών. Πιθανότατα και άλλοι μηχανισμοί να παίζουν ρόλο στην ανθεκτικότητα στο bifenthrin. Επίσης, τα fenpropathrin και fluvalinate χρησιμοποιήθηκαν στα ίδια στελέχη. Φαίνεται πως οι μεταλλαγές αυτές προσδίδουν υψηλά επίπεδα προστασίας και παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανθεκτικότητα σε αυτά τα εντομοκτόνα.