The role of TPL2 kinase in inflammation and cancer

Abstract

Several clinical and epidemiological studies have provided evidence supporting that hepatic inflammation and tissue damage is the critical cause of liver disease directing the development of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). Hence, liver disease corresponds to a major healthcare issue, capable of debilitating many patients worldwide and overall, associated with high morbidity and mortality rate. Improved understanding of immune-mediated liver injury may assist the development of therapeutic approaches to this widespread clinical problem. Operating at the interface of gastrointestinal and systemic blood circulation, the liver is the recipient of a multitude of metabolic, immune and microbial products which must be appropriately handled to maintain tissue homeostasis. Unlike the majority of secondary immune organs, the liver is typified by an over-representation of cellular components of the innate immunity such as Kupffer, dendritic, natural killer (NK) and NKT cells endowed with antigen recognition and regulation of immunogenic versus tolerogenic functions. Disruption of immunological balance as a result of viral infection, autoimmune reactions, excess alcohol consumption or metabolic disease leads to exaggerated and uncontrolled inflammation, hepatocyte death and, eventually, permanent loss of organ function. Irrespective of the cause, liver injury seems to be facilitated by immune effector mechanisms that are common to various liver diseases. Emerging evidence underscores an instrumental role for NKT cells in orchestrating immune homeostasis and disease pathogenesis in the liver. NKT cells are a heterogeneous group of nonconventional T lymphocytes which are found with highest frequency in the liver. Studies using a mouse model of fulminant hepatitis induced by concanavalin A (ConA) have revealed a major pathogenic role for iNKT cells in liver injury. Upon activation iNKT cells produce copious amounts of immunoregulatory molecules, including the TH1 cytokine interferon-γ (IFN-γ) and the TH2 cytokine interleukin-4 (IL-4) which endow them with the capacity to bridge innate and adaptive responses, direct the licensing of other immune cell types and thus orchestrate inflammatory immune reactions in the liver. Remarkably, the intracellular signaling pathways that mediate the pathogenic functions of iNKT cells remain poorly defined. In this regard, we reasoned that TPL2 (tumor progression locus 2; also known as COT or MAP3K8), a serine-threonine MAP3 kinase mitogen activated protein kinase, could participate in signaling pathways in iNKT cells. TPL2 plays an obligatory role in signal transduction on the MEK/ERK axis downstream of receptors involved in innate and adaptive immunity, including Toll-like receptors, the tumor necrosis factor (TNF) receptor, interleukin-1beta (IL-1β), CD40 and G-protein–coupled receptors (GPCRs). The aim of this PhD thesis was to characterize in vivo the functional role of TPL2 kinase in immune-mediated liver injury and hepatocellular carcinoma.In Chapter I, we present experimental evidence demonstrating that TPL2 is a crucial signaling factor in iNKT cells and powerful mediator of hepatic inflammation. We show that genetic ablation of TPL2 in the mouse ameliorates liver injury induced by Concanavalin A and impinges on hallmarks of iNKT cell activation, including production of the effector cytokines IL-4 and IFN-γ, accumulation of neutrophils and licensing and activation of other immune cell types in the liver. The pivotal role of TPL2 in iNKT cell functions is endorsed by adoptive transfer experiments and studies using the iNKT-specific ligand alpha-galactosylceramide which causes mild hepatitis in the mouse in a TPL2-dependent manner. A TPL2 kinase inhibitor mirrors the effects of genetic ablation of TPL2 in vivo and reveals ERK and Akt as the TPL2-regulated signaling pathways responsible for IL-4 and IFN-γ expression through the activation of the transcription factors JunB and NFAT. Overall, data presented in this thesis uncover a novel function of TPL2 as a key mediator of iNKT signal transduction during immune-mediated liver injury. Congruent with this regulatory link, TPL2 is shown to confer pathogenic effects in mouse models of immune-mediated hepatitis. Further understanding of the cellular and molecular processes involved in the development of autoimmune liver diseases may open new avenues for the development of more effective therapies for patients who suffer from inflammatory liver disease. These findings provide new insight into the intracellular pathways that mediate the pathogenic effects of iNKT cells and highlight TPL2 as a promising target suggesting that its modulation has the potential to minimize the severity of inflammatory liver diseases. In Chapter II, we study the role of TPL2 kinase in HCC. For this purpose, we have used a model of chemical carcinogen induced-HCC in wild type and in tpl2-/- mice to investigate the impact of TPL2 kinase and its possible contribution in inflammatory mechanisms during development of hepatocellular carcinoma. The results showed that TPL2 does not have a significant role in HCC development.

Kλινικές και επιδημιολογικές μελέτες παρέχουν στοιχεία που υποστηρίζουν ότι η φλεγμονή και η επαγόμενη βλάβη του ήπατος αποτελούν την κύρια αιτία για την ανάπτυξη της ηπατικής νόσου καταλήγοντας στην εμφάνιση κίρρωσης του ήπατος και ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HCC). Ως εκ τούτου, η νόσος του ήπατος συνιστά παγκοσμίως ένα μείζον πρόβλημα υγείας καθώς καταβάλει πολλούς ασθενείς και συνολικά συσχετίζεται με υψηλά ποσοστά νοσηρότητας και θνησιμότητας. Η βαθύτερη κατανόηση των μηχανισμών του ανοσοποιητικού συστήματος που μεσολαβούν για την πρόκληση ηπατικής βλάβης θα συμβάλλει σημαντικά στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων σε αυτό το διαδεδομένο κλινικό ζήτημα. Το ήπαρ, λειτουργώντας ως ένα ζωτικό όργανο με κομβική θέση μεταξύ του γαστρεντερικού συστήματος και της συστηματικής κυκλοφορίας του αίματος είναι ο αποδέκτης πληθώρας μεταβολικών, ανοσολογικών και μικροβιακών προϊόντων τα οποία πρέπει να διαχειρίζεται κατάλληλα για την διατήρηση της ομοιόστασης του οργανισμού. Σε αντίθεση με την πλειοψηφία των δευτερογενών ανοσοποιητικών οργάνων, το ήπαρ χαρακτηρίζεται από την παρουσία διαφόρων κυτταρικών τύπων της φυσικής ανοσίας όπως κύτταρα Kupffer, δενδριτικά, φυσικούς φονιάδες (NK), φυσικούς φονιάδες T (NKT) τα οποία έχουν κατεξοχήν περιγραφεί για τον εδραιωμένο ρόλο τους τόσο στην αναγνώριση αντιγόνου όσο και στις λειτουργίες ρύθμισης των μηχανισμών ανοσοποίησης έναντι των μηχανισμών ανοχής. Η διακοπή της ανοσολογικής ισορροπίας εξαιτίας ιογενούς λοίμωξης, αυτοάνοσων αντιδράσεων, υπερβολικής κατανάλωσης αλκοόλ ή μεταβολικών διαταραχών οδηγεί σε εκτεταμένη και ανεξέλεγκτη φλεγμονή, θάνατο των ηπατοκυττάρων και τελικά σε μόνιμη απώλεια της λειτουργίας του ήπατος. Οι μηχανισμοί του ανοσοποιητικού συστήματος που μεσολαβούν για την πρόκληση ηπατικής βλάβης φαίνεται να είναι κοινοί σε αρκετές ασθένειες του ήπατος, ανεξάρτητα από την αιτία. Πρόσφατες μελέτες αναδεικνύουν τον κεντρικό ρόλο των ΝΚΤ κυττάρων υπογραμμίζοντας την σημασία τους στην ενορχήστρωση της ανοσολογικής ομοιόστασης και στην παθογένεια νόσων του ήπατος. Τα ΝΚΤ κύτταρα αποτελούν μια ετερογενή ομάδα μη συμβατικών Τ λεμφοκυττάρων και συναντώνται σε υψηλή συχνότητα στο ήπαρ. Ο παθογόνος ρόλος των iΝΚΤ κυττάρων έχει αποκαλυφθεί από μελέτες μοντέλου ποντικού της κεραυνοβόλου ηπατίτιδας που προκαλείται από χορήγηση κονκαναβαλίνης Α (ConA). Επιπρόσθετες μελέτες έχουν δείξει ότι μετά την ενεργοποίηση τους, τα iNKT κύτταρα παράγουν άφθονες ποσότητες ανοσορυθμιστικών μορίων συμπεριλαμβανομένου της TH1 κυτταροκίνης, ιντερφερόνης-γ (IFN-γ) και της TH2 κυτταροκίνης ιντερλευκίνης-4 (IL-4) οι οποίες τους προσδίδουν την ικανότητα να γεφυρώσουν τις αποκρίσεις μεταξύ φυσικής και επίκτητης ανοσίας κατευθύνοντας έτσι την ενεργοποίηση άλλων κυτταρικών τύπων του ανοσοποιητικού συστήματος και κατά συνέπεια ενορχηστρώνουν τις φλεγμονώδεις ανοσολογικές αντιδράσεις στο ήπαρ. Είναι δε αξιοσημείωτο ότι τα ενδοκυτταρικά σηματοδοτικά μονοπάτια που μεσολαβούν για τις παθογόνες διεργασίες των iNKT κυττάρων παραμένουν σε μεγάλο βαθμό, απροσδιόριστα. Στην κατεύθυνση αυτή, η μελέτη της κινάσης TPL2 (tumor progression locus 2, γνωστή και ως COT ή MAP3K8) η οποία συνιστά μια MAP3K κινάση σερίνης/ θρεονίνης που ενεργοποιείται από μιτογόνα, φαίνεται να είναι πολλά υποσχόμενη καθώς συμμετέχει σε σημαντικά σηματοδοτικά μονοπάτια. Η πρωτεΐνη TPL2 χαρακτηρίζεται για τον εδραιωμένο ρόλο στην μεταγωγή σημάτων στον άξονα MEK/ERK καθοδικά των υποδοχέων που εμπλέκονται στη φυσική και επίκτητη ανοσία συμπεριλαμβανομένων των υποδοχέων Toll-like, την οικογένεια των υποδοχέων του παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF), την ιντερλευκίνη-1β (IL-1β) και των υποδοχέων συζευγμένων με G-πρωτεΐνες (GPCRs). Ο σκοπός της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής είναι ο in vivo χαρακτηρισμός του λειτουργικού ρόλου της κινάσης TPL2 σε μοντέλα ανοσο-μεσολαβούμενης ηπατικής βλάβης και ηπατοκυτταρικού καρκινώματος.Στο πρώτο μέρος της διατριβής, παρουσιάζω πειραματικά δεδομένα τα οποία αποδεικνύουν ότι η κινάση TPL2 παίζει σημαντικό ρόλο ως κρίσιμος διαμεσολαβητής της μεταγωγής σημάτων των iNKT κυττάρων και ταυτόχρονα ένας κρίσιμος παθογενετικός παράγοντας που μεσολαβεί για την φλεγμονή του ήπατος. Η γονιδιακή απαλοιφή της κινάσης TPL2 στο ποντίκι βελτιώνει την ηπατική βλάβη που επάγεται από την χορήγηση κονκαναβαλίνης Α (ConA) και επηρεάζει χαρακτηριστικά γνωρίσματα της ενεργοποίησης των iNKT κυττάρων, που περιλαμβάνουν την παραγωγή των ρυθμιστικών κυτταροκινών IL-4 και ΙFN-γ και τη συσσώρευση ουδετερόφιλων επιτρέποντας την περαιτέρω ενεργοποίηση άλλων τύπων ανοσοποιητικών κυττάρων στο ήπαρ. Ο σημαντικός ρόλος της TPL2 αναφορικά με τις λειτουργίες των iNKT κυττάρων ενισχύεται από πειράματα παθητικής μεταφοράς που διενεργήθηκαν καθώς και από μελέτες με χρήση του αGalCer. Το αGalCer είναι ένα γλυκολιπίδιο που αποτελεί τον ειδικό ενεργοποιητή των iNKT κυττάρων προκαλώντας ήπια ηπατίτιδα στο ποντίκι κατά τρόπο, όπως δείχθηκε, εξαρτώμενο από την κινάση TPL2. Η χρήση του εκλεκτικού αναστολέα της καταλυτικής ενεργότητας της TPL2 in vivo επαληθεύει με τον ίδιο τρόπο την επίδραση της γονιδιακής απολοιφής της TPL2 και ταυτόχρονα αποκαλύπτει ότι η κινάση αυτή είναι απαραίτητος διαμεσολαβητής και ρυθμιστής των σηματοδοτικών μονοπατιών ενεργοποίησης των πρωτεϊνών ERK και Akt που οδηγούν στην έκφραση των ρυθμιστικών κυτταροκίνων IL-4 και IFN-γ, μέσω της ενεργοποίησης των μεταγραφικών παραγόντων JunB και NFAT. Συνολικά, τα δεδομένα που παρουσιάζονται στο συγκεκριμένο μέρος της διατριβής αποκαλύπτουν τον καινοτόμο ρόλο της κινάσης TPL2 ως κυρίου διαμεσολαβητή της μεταγωγής σημάτων των iNKT κυττάρων. Επιπρόσθετα και σε συμφωνία με τα δεδομένα αυτά, αποδεικνύεται ότι η κινάση TPL2 έχει παθογόνες επιδράσεις στα πειραματικά μοντέλα ανοσομεσολαβούμενης ηπατίτιδας που μελετήθηκαν. Περαιτέρω κατανόηση των κυτταρικών και μοριακών διαδικασιών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη των αυτοάνοσων παθήσεων του ήπατος δύναται να ανοίξoυν νέες προοπτικές για την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπειών σε ασθενείς που πάσχουν από φλεγμονώδεις νόσους του ήπατος. Τα νέα ευρήματα που παρουσιάζονται στην παρούσα εργασία συμβάλλουν και στην κατανόηση των ενδοκυττάριων μονοπατιών που μεσολαβούν για τις παθογόνες επιδράσεις των iΝΚΤ κυττάρων με την σημαντική συμβολή της κινάσης TPL2. Τα αποτελέσματα αυτά αναδεικνύουν τη TPL2 ως ένα πολλά υποσχόμενο στόχο για την ανάπτυξη θεραπειών που θα βελτιώνουν τις φλεγμονώδους παθήσεις του ήπατος.Στόχος του δεύτερου μέρους της διατριβής ήταν η μελέτη του ρόλου της TPL2 στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC). Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε ένα ζωϊκό μοντέλο HCC που επάγεται μετά από χορήγηση της καρκινογόνου ουσίας DEN σε ποντίκια αγρίου τύπου και tpl2-/- προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση της κινάσης TPL2 και η πιθανή συμβολή της στην ανάπτυξη του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. Ωστόσο, τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η απαλοιφή της TPL2 στο ποντίκι δεν οδήγησε σε σημαντικές μεταβολές στον αριθμό και το μέγεθος των όγκων σε σχέση με πειραματόζωα που φέρουν ακέραιη έκφραση της κινάσης αυτής, υποδεικνύοντας ότι η TPL2 δεν παίζει σημαντικό ρόλο σε αυτό το μοντέλο HCC.