Μελέτη της επίδρασης του ενεργοποιού του πλασμινογόνου του τύπου της ουροκινάσης στην παθογένεια της κολίτιδας

Abstract

The relationship between inflammation and cancer (development, progression and metastasis) is well established. Recent data suggest that tumor growth and survival may be more dependent upon inflammatory events and thus more readily reversible than previously thought. On the other hand, cancer is considered as a wound that fails to heal. Urokinase-type plasminogen activator (uPA) is a protease that is known to participate in both inflammation and wound healing. Numerous studies highlight the role of the uPA system in tumor progression, invasion and metastasis and uPA is now considered a tumor promoting factor. However, there are no studies examining the possible role of uPA in the early stages of carcinogenesis, with the exception of one study demonstrating that the lack of uPA reduces the development of intestinal adenomas in Apcmin/+ mice. uPA activates Tgf-β1, which in the early stages of cancer is known to act as a tumor suppresor. The present study aimed to investigate the effect of uPA deficiency on the outcome of dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. Wild-type (WT) and uPA-deficient (uPA-/-) BALB/cJ mice were treated with 3.5% DSS or remained untreated. Mice were necropsied either one week or seven months after DSS treatment. Inflammation, epithelial integrity and dysplastic/pre-neoplastic lesions were scored. Tissues were immunohistochemically labeled for β-catenin, E-cadherine, Tgf-β1, IL-6 and IL-17. Proliferating and apoptotic cells were identified by the detection of Ki-67 and caspase-3, respectively. T-cells, regulatory T-cells, macrophages, mast cells and granulocytes were also identified immunohistochemically. uPA and the active form of Tgf-β1 were quantified in the bowel mucosa by ELISA. IL-6, IL-10, TNF-α, Tgf-β1, Tgf-βRII and SMAD-4 expression was determined by real-time PCR. The inflammatory cells in the colon mucosa and the immunohistochemically labeled cytokines were morphometrically assessed. At seven months, with no colitis evident, half of the uPA-/-+DSS mice had large colonic polypoid adenomas whereas WT+DSS mice did not. Moreover, uPA-/-+DSS mice had more inflammatory cells and significantly more dysplasia than the WT+DSS mice. In order to investigate the reason why uPA-/- mice developed polypoid adenomas whereas WT mice did not, the colon was examined at an earlier time point. One week post DSS treatment there were typical DSS-colitis lesions in both WT and uPA-/- mice. The affected colon of uPA-/-+DSS mice, however, had features of delayed ulcer re-epithelialization and dysplastic lesions of higher grade developing on the basis of a significantly altered mucosal inflammatory millieu. The later was characterized by more neutrophils and macrophages, less regulatory T-cells, significantly upregulated cytokines, including IL-6, IL-17, ΤΝF-α and IL-10 and lower levels of active Tgf-β1 compared to WT+DSS mice. Dysfunctional regulatory T-cells, more robust protumorigenic inflammatory events and inherited inability to produce adequate amounts of extracellular active Tgf-β1 due to uPA deficiency are interlinked as probable explanations for the inflammatory-induced neoplasmatogenesis in the colon of uPA-/-+DSS mice.

Η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ φλεγμονής και καρκίνου είναι πλέον ευρέως αποδεκτή. Τα αποτελέσματα πρόσφατων ερευνών δείχνουν ότι η ανάπτυξη και η επιβίωση των καρκινικών κυττάρων εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από τους παράγοντες της φλεγμονής. Ορισμένοι ερευνητές θεωρούν τον καρκίνο σαν μια «πληγή» που ο οργανισμός αποτυγχάνει να επουλώσει. Ο ενεργοποιός του πλασμινογόνου του τύπου της ουροκινάσης (uPA) είναι μία πρωτεάση που συμμετέχει τόσο στη φλεγμονή όσο και στην επούλωση. Πολλές εργασίες καταδεικνύουν το ρόλο του συστήματος της ινωδόλυσης στην εξέλιξη, διείσδυση και μετάσταση του καρκίνου, ενώ ο uPA θεωρείται παράγοντας που προάγει την εξέλιξη του καρκίνου. Ωστόσο, δεν υπάρχουν μελέτες που να εξετάζουν τον πιθανό ρόλο του uPA στα πρώιμα στάδια της καρκινογένεσης. Εξαίρεση σε αυτό αποτελεί μία έρευνα, σύμφωνα με την οποία τα Apcmin/+ ποντίκια από τα οποία λείπει το γονίδιο που κωδικοποιεί τον uPA εμφανίζουν λιγότερα αδενώματα στο έντερο. Ο uPA ενεργοποιεί τον Tgf-β1, ο οποίος στα πρώιμα στάδια της καρκινογένεσης έχει ογκο-κατασταλτική δράση. Στόχος της συγκεκριμένης διατριβής ήταν η διερεύνηση της επίδρασης της απουσίας του uPA στην κολίτιδα που προκαλείται από το DSS. Φυσιολογικοί (WT) και uPA-/- BALB/cJ ποντικοί έλαβαν DSS με το πόσιμο νερό. Η νεκροτομή των πειραματόζωων πραγματοποιήθηκε μία εβδομάδα ή επτά μήνες μετά την παύση χορήγησης του DSS. Η φλεγμονή, η ακεραιότητα του επιθηλίου και οι δυσπλαστικές/προ-νεοπλασματικές αλλοιώσεις βαθμονομήθηκαν ξεχωριστά. Σε τομές παραφίνης σημάνθηκαν με ανοσοϊστοχημικά η β-κατενίνη, η Ε-καντχερίνη, ο Tgf-β1, η IL-6 και η IL-17. Για τη σήμανση των κυττάρων σε πολλαπλασιασμό και απόπτωση χρησιμοποιήθηκαν αντισώματα κατά του ki-67 και της κασπάσης-3, αντίστοιχα. Με ανοσοϊστοχημεία σημάνθηκαν επίσης τα Τ-λεμφοκύτταρα, τα ρυθμιστικά Τ-λεμφοκύτταρα, τα μακροφάγα, τα σιτευτικά κύτταρα και τα ουδετερόφιλα. Η ενεργός μορφή του Tgf-β1 και ο uPA προσδιορίστηκαν ποσοτικά στο βλεννογόνο του εντέρου με τη μέθοδο ELISA. Επίσης, χρησιμοποιώντας real-time PCR έγινε ποσοτικός προσδιορισμός των γονιδίων IL-6, IL-10, Tgf-β1, Tgf-βRII και SMAD-4. Τα φλεγμονικά κύτταρα και οι κυτταροκίνες αξιολογήθηκαν ποσοτικά με κατάλληλη μορφομετρική μέθοδο. Επτά μήνες μετά τη χορήγηση του DSS οι πέντε από τους έντεκα (5/11) uPA-/-+DSS ποντικοί εμφάνισαν πολυποειδή αδενώματα, ενώ κανένας από τους WT+DSS ποντικούς δεν εμφάνισε πολύποδα. Επιπλέον, οι uPA-/-+DSS ποντικοί είχαν περισσότερα φλεγμονικά κύτταρα και περισσότερες αλλοιώσεις δυσπλασίας από τους WT+DSS ποντικούς. Προκειμένου να διερευνηθεί γιατί οι uPA-/-+DSS ποντικοί εμφάνισαν πολύποδες, ενώ οι WT+DSS ποντικοί όχι, πραγματοποιήθηκε εξέταση του παχέος εντέρου σε πιο πρώιμη χρονική στιγμή. Μία εβδομάδα μετά τη διακοπή χορήγησης του DSS, και οι δύο ομάδες που έλαβαν DSS εμφάνισαν τις τυπικές αλλοιώσεις της κολίτιδας που προκαλεί το DSS. Ωστόσο, οι uPA-/-+DSS ποντικοί εμφάνισαν περισσότερες διαβρώσεις και πιο προχωρημένου βαθμού αλλοιώσεις δυσπλασίας. Στο βλεννογόνο του παχέος εντέρου των uPA-/-+DSS ποντικών παρατηρήθηκαν περισσότερα ουδετερόφιλα και μακροφάγα, λιγότερα ρυθμιστικά Τ-λεμφοκύτταρα, αύξηση των κυτταροκινών IL-6, IL-17, TNF-α και IL-10 και σημαντική μείωση των επιπέδων του ενεργού Tgf-β1 συγκριτικά με τους WT+DSS ποντικούς. Τα μη λειτουργικά ρυθμιστικά Τ-λεμφοκύτταρα, η πιο επίμονη φλεγμονική αντίδραση και η κληρονομούμενη ανικανότητα παραγωγής επαρκούς ποσότητας ενεργού Tgf-β1 εξωκυτταρικά, λόγω της έλλειψης του uPA, αποτελούν τις πιθανές εξηγήσεις για τη νεοπλασματογένεση που σχετίζεται με τη φλεγμονή στο παχύ έντερο των uPA-/-+DSS ποντικών.